保健食品中西地那非化學發(fā)光免疫分析方法研究

程 智，張詠儀，楊金易，徐振林，王 弘，雷紅濤，孫遠明，沈玉棟

（華南農業(yè)大學 食品學院 廣東省食品質量安全重點實驗室，廣東 廣州 510642）

西地那非（Sildenafil，SD）是美國食品藥品管理局（FDA）于1998年批準用于治療性功能障礙的一種5型磷酸二酯酶（Phosphodiesterase 5，PDE5）抑制劑［1］，是已批準的3個壯陽藥之一，其副作用主要有頭痛、背痛以及視力聽力障礙，與硝酸酯類藥物同時服用時會顯著降低血壓導致意識喪失甚至死亡等［2］。因此，2012 年3 月中國國家食品藥品監(jiān)督管理總局發(fā)布的“食藥監(jiān)辦?；?012］33 號”文件中明確禁止在保健食品中添加西地那非。然而，部分保健食品企業(yè)為了加強產品功效，在經(jīng)濟利益驅使下，向產品中非法添加那非類藥物，其中以西地那非違禁添加問題最為突出，如上海食品藥品檢驗所2016～2018年檢出的458批次非法添加化學藥物的食品中，西地那非檢出428批次［3］，河北省藥品檢驗研究院于2017 年檢出的12 批次非法添加化學藥物的酒類產品中，西地那非檢出8 批次［4］，深圳市計量質量檢測研究院2018 年檢出的15 批次非法添加藥物的功能酒中，西地那非陽性8 批次［5］。因此，建立保健食品中西地那非藥物靈敏準確的檢測方法，對食品安全監(jiān)管具有重要實際意義。

目前，針對保健食品中那非類藥物的檢測方法主要是基于色譜－質譜聯(lián)用技術的大型儀器確證分析方法［6－12］，該類方法具有準確、靈敏等特點，但也存在儀器昂貴，前處理復雜，檢測成本高等問題，因而難以在基層普及。免疫分析方法［13－18］具有特異性強、靈敏度高、成本低、快速等優(yōu)點，是儀器分析方法的互補方法。近年來，關于西地那非殘留的免疫分析方法陸續(xù)有少量報道，如間接競爭酶聯(lián)免疫吸附分析（Indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay，icELISA）［13－16］和免疫層析分析（Immunochromatography assay，ICA）［17－18］，樣品檢測靈敏度約在5～80 μg/mL 之間，不能滿足保健食品中禁用藥物西地那非的測定需求。因此，開發(fā)更為靈敏可靠的技術方法，對有效監(jiān)測保健食品中非法添加西地那非的食品安全問題，保障人體健康具有重要意義。

直接競爭化學發(fā)光酶免疫分析（Direct competitive chemiluminescence enzyme immunoassay，dcCLEIA）方法是以酶聯(lián)免疫吸附分析原理為基礎發(fā)展起來的新一代超靈敏免疫分析技術［19－20］。該方法以魯米諾等發(fā)光底物作為信號輸出探針，在辣根過氧化物酶（HRP）催化下，使過氧化氫釋放出活性氧，從而將底物魯米諾氧化為激發(fā)態(tài)，最后激發(fā)態(tài)躍遷回基態(tài)實現(xiàn)發(fā)光。dcCLEIA 具有化學發(fā)光信號靈敏度高，可有效規(guī)避基質背景干擾，檢測結果穩(wěn)定等突出優(yōu)勢［21－22］；同時，采用基于酶標抗體的直接競爭模式，減少了酶標二抗的反應步驟，簡化了檢測過程，節(jié)省了檢測時間，提高了檢測效率。因此，本研究利用前期獲得的抗體制備酶標抗體，開展了保健食品中西地那非超靈敏檢測的dcCLEIA 方法研究，以期為保健食品安全監(jiān)管提供技術支持。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

UV－160A 紫外－可見掃描儀（日本Kyoto 公司）；MK3 多功能酶標儀（美國Thermo 公司）；DEM－3自動洗板機（北京拓普分析儀器有限責任公司）；MS3 旋渦混合器（i國IKA 公司）；96 孔不透明白色發(fā)光板（廈門市云鵬科技發(fā)展有限公司）；AB SCIEX 5500 三重四極桿質譜儀（美國AB SCIEX 公司）。

西地那非、瓦地那非（Vardenafil）、米羅那非（Mironafil）、他達那非（Tadalafil）、紅地那非（Acetildenafil）等藥物購自Alfa Aesar 公司；西地那非多克隆抗體和包被原（SDBA－OVA）由本實驗室［14］自制；魯米諾化學發(fā)光底物液（A 液：4 mg 魯米諾鈉鹽（Luminol－Na）溶于20 mL 水中）和底物緩沖液（B液：2 mg 對碘酚溶于100 μL 二甲基亞砜中，加入4 μL 3%的雙氧水）；包被緩沖液（pH 9.6，0.1 mol/L碳酸鹽緩沖液）、封閉液（0.2 g/L KCl，0.2 g/L KH2PO4，2.9 g/L Na2HPO4·12H2O，8.5 g/L NaCl，0.05%Tween－20，5%脫脂奶粉）、洗滌液（2.9 g/L Na2HPO4·12H2O，8.5 g/L NaCl，0.05%Tween－20）、稀釋液（磷酸鹽吐溫溶液，PBST，5%甲醇，0.1% Tween－20，0.01 mol/L pH 7.4 磷酸鹽溶液）、終止液（10%H2SO4溶液）等溶液均為實驗室自配［14，23］；其它試劑為國產分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 辣根過氧化物酶標記抗體（HRP－Ab）的制備與評價 采用過碘酸鈉法［24］對西地那非兔多克隆抗體進行辣根過氧化物酶（HRP）標記制備酶標抗體HRP－Ab。然后，將酶標抗體稀釋成系列濃度，在1 μg/mL包被原濃度下，采用酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）法測定不同濃度的抗體與包被抗原反應的A450nm值（450 nm可見光波長下的吸光度值），將讀數(shù)為1.0左右對應的酶標抗體稀釋倍數(shù)定義為效價。同時，加入500 ng/mL 西地那非標準品與抗體發(fā)生競爭反應，讀取A450nm值，并計算抑制率（Inhibition rate，IR），計算公式為：IR（%）=（1－B/B0）×100%，其中，B0為未添加藥物的微孔吸光值，B為添加藥物的微孔吸光值。

1.2.2 dcCLEIA實驗步驟 將包被原用包被液稀釋至適當濃度，以每孔100 μL加入到化學發(fā)光板中，37 ℃下孵育過夜。洗滌液洗板2 次后，拍干備用。每孔加入120 μL 封閉液，37 ℃下封閉3 h 后甩干孔內液體，置于37 ℃烘箱內烘干備用。用磷酸鹽緩沖液將西地那非標準品稀釋成0、0.000 2、0.002、0.02、2、20、200 ng/mL，酶標抗體稀釋至0.5 mg/mL。每孔分別加入不同濃度的藥物與酶標抗體各50 μL，振蕩混勻，37 ℃下孵育40 min，洗板5次后拍干；加入100 μL 等體積混合的化學發(fā)光A 液和B液，振蕩混勻后，用化學發(fā)光儀讀取相對發(fā)光強度（Relative light units，RLU）。

1.2.3 dcCLEIA 方法的建立 參照文獻［23］步驟，對包被原濃度、抗體稀釋倍數(shù)、封閉液和洗滌液的吐溫含量、稀釋液PBST 的甲醇添加量以及競爭反應時間進行考察。按照“1.2.2”步驟操作，以西地那非濃度負對數(shù)為橫坐標，RLU 值為縱坐標，繪制標準曲線，通過比較最大化學發(fā)光值RLUMAX、IC50、RLUMAX/IC50選擇最佳工作條件。確定最佳工作條件后以RLU 值為縱坐標，標準品濃度負對數(shù)值為橫坐標，采用四參數(shù)擬合繪制標準曲線，并計算西地那非的檢出限（LOD，IC10）、半抑制濃度（IC50）和線性范圍（IC20～IC80）。

1.2.4 方法特異性 采用交叉反應率（Cross-reactivity，CR）評價方法的特異性，根據(jù)“1.2.3”方法擬合獲得西地那非藥物及其類似物的IC50，計算CR，計算公式如下：

1.2.5 樣品前處理方法 ①口服液類：準確吸取1 mL 樣品置于50 mL 離心管中，加入10 mL 二氯甲烷，振蕩5 min 后超聲10 min，4 000 r/min 離心5 min 后取上清液，旋蒸后用1 mL 甲醇復溶并稀釋10倍，備用。②膠囊、片劑類：準確稱取研細的樣品1 g于50 mL離心管中，加入5 mL pH 5.0～6.0的鹽酸水溶液，振蕩5 min后超聲10 min，4 000 r/min離心5 min后取上清液，調至pH 9.0，加入10 mL二氯甲烷萃取，振蕩5 min后超聲10 min，4 000 r/min離心5 min，反復萃取3次，合并有機層，旋蒸后用1 mL甲醇復溶并稀釋20倍，備用。

1.2.6 加標回收與儀器驗證 根據(jù)所建立dcCLEIA 方法的檢測范圍，在經(jīng)過前處理的陰性樣品中加入低、中、高3 個濃度水平的西地那非標準品后用dcCLEIA 方法測定，計算出各樣品的加標回收率以及相對標準偏差（Relative standard deviation，RSD）。同時，利用dcCLEIA 與HPLC－MS/MS 標準確證法（SN/T 4054－2014）［25］對隨機盲樣進行比對檢測，評價方法可靠性。

2 結果與討論

2.1 酶標抗體性質的鑒定

將“1.2.1”制得的5 mg/mL 酶標抗體稀釋10 倍至0.5 mg/mL 后，測定并計算酶標抗體HRP－Ab 的效價及抑制率。結果顯示在500 ng/mL的西地那非藥物質量濃度下抑制率達到90%以上，此時效價為1∶400（圖1），考慮初始的10倍稀釋，其原始酶標抗體效價應為1∶4 000，說明抗體酶標后保持了良好的分析性能。

圖1 HRP－Ab的效價抑制曲線Fig.1 Titer and inhibition curve of HRP－Ab

2.2 dcCLEIA工作條件的優(yōu)化

對影響dcCLEIA 的實驗參數(shù)進行了優(yōu)化，以RLUMAX/IC50值作為評價標準，比值越大，說明靈敏度越高，重復性越好［24］。對包被原濃度、抗體稀釋倍數(shù)、封閉液和洗滌液的吐溫－20 含量、稀釋液PBST 甲醇添加量以及競爭反應時間等條件進行優(yōu)化。最終選擇RLUMAX/IC50較高、RLUMAX適中、IC50較低的條件作為最佳工作條件。結果表明，最佳工作條件為：包被原質量濃度為41.67 ng/mL，酶標抗體質量濃度為1.25 μg/mL，封閉液和洗滌液吐溫－20 含量為0.05%，稀釋液甲醇添加量為5%，競爭反應時間為40 min。

2.3 標準曲線的建立

根據(jù)確定的優(yōu)化條件，以RLU 值為縱坐標，西地那非標準品濃度的負對數(shù)為橫坐標，繪制方法的標準曲線，并采用四參數(shù)擬合得到西地那非檢測的IC50為0.17 ng/mL，線性檢測范圍（IC20～IC80）為0.024～1.21 ng/mL，檢出限IC10為0.008 ng/mL，達到了pg/mL 水平，相比報道的ELISA 與ICA 方法［13－18］，靈敏度顯著提高。另外，由于采用直接競爭法，減少了酶標二抗捕獲一抗步驟（一般需要30 min以上），將檢測時間縮短至40 min，較ELISA 檢測方法縮短了20 min以上，節(jié)省了時間，提高了檢測效率（表1）。

表1 已報道的西地那非ELISA檢測方法與本方法的比較Table 1 Comparison between the proposed dcCLEIA and other ELISA methods for detection of sildenafil

2.4 方法特異性

選擇主要的結構或功能類似物，利用dcCLEIA測定交叉反應率。以西地那非作為參照（交叉反應率100%），結果顯示（表2），該方法對主要結構功能類似物瓦地那非以及米羅那非的交叉反應率分別為48.5%與62.5%，與他達那非和紅地那非類藥物無明顯交叉反應（CR ＜0.1%）。瓦地那非、米羅那非與西地那非的結構類似度較高，說明抗體主要識別其共有結構部分，因而此方法可用于這3 類結構藥物的半定量檢測。

表2 西地那非結構功能類似物的交叉反應率Table 2 Cross-reactivity of sildenafil analogues by dcCLEIA

2.5 基質效應的消除

樣品經(jīng)“1.2.5”前處理后用PBST 稀釋適當倍數(shù)，以西地那非為標準品進行dcCLEIA 測定并繪制標準曲線，考察基質效應消除情況。結果表明（圖2）：口服液基質以PBST稀釋10倍，膠囊和片劑基質以PBST稀釋20倍后，抑制曲線與西地那非標準曲線均能基本重合，表明樣品基質效應基本消除。

圖2 實際樣品基質效應的消除Fig.2 Elimination of matrix effect in real samples

2.6 實際樣品分析

根據(jù)所建方法的靈敏度和線性范圍，向口服液、片劑、膠囊3種陰性樣品中添加低、中、高3個濃度水平的西地那非藥物，采用建立的dcCLEIA 方法進行檢測，計算回收率與相對標準偏差（表3）。結果表明：西地那非樣品的加標回收率為82.0%～114%，RSD 均小于15%。同時采用dcCLEIA 方法與HPLC－MS/MS 方法對隨機盲樣進行檢測，兩種方法的檢測結果具有良好一致性（表4），相關系數(shù)（r2）為0.991。說明該方法準確性良好，可滿足實際樣品檢測需求。

表3 實際樣品中西地那非的加標回收實驗結果（n=3）Table 3 Recoveries of sildenafil in spiked samples by dcCLEIA（n=3）

表4 隨機盲樣中西地那非的測定（n=3）Table 4 Determination of sildenafil in random blind samples by dcCLEIA and HPLC－MS/MS（n=3）

3 結 論

本研究建立了保健食品中西地那非的dcCLEIA 檢測方法，方法檢出限達pg/mL 級，與他達那非和紅地那非等類似物無交叉反應。實際樣品的加標回收率為82.0%～114%，RSD 均小于15%。盲樣檢測結果與HPLC－MS/MS方法相關性良好，檢測時間為40 min，可用于實際樣品的快速檢測。