苗藥滾山珠HPLC指紋圖譜及化學(xué)模式識別研究

文 敏，周 欣，趙 超，陳華國，龔小見*

1貴州師范大學(xué) 貴州省山地環(huán)境信息系統(tǒng)與生態(tài)環(huán)境保護(hù)重點實驗室；2貴州師范大學(xué) 喀斯特山地生態(tài)環(huán)境保護(hù)與資源利用協(xié)同創(chuàng)新中心；3貴州師范大學(xué) 貴州省藥物質(zhì)量控制及評價技術(shù)工程實驗室；4貴州師范大學(xué) 天然藥物質(zhì)量控制研究中心，貴陽 550001

滾山珠(PrionobelumqianensisChen)，為澤馬陸科(Zephroniidae)鋸刺馬陸屬(Prionobelum)黔鋸刺馬陸的干燥全蟲，體呈扁長圓柱形，棲息于山坡較潮濕處、枯枝腐葉或石塊下，主要分布于貴州、云南等地區(qū)。滾山珠為藥用全蟲，具有清熱、消腫止痛，舒筋活血等功效，主要用于治療筋脈拘攣、跌打損傷、骨折腫痛等病狀，在《中華本草-苗藥卷》《貴州苗族醫(yī)藥研究與開發(fā)》等書籍中均有記載[1,2]。在貴州苗族地區(qū)，用于炎癥的治療非常廣泛，對腫瘤的治療效果極其顯著。但是，目前國內(nèi)外關(guān)于滾山珠的相關(guān)基礎(chǔ)研究非常薄弱，更缺乏質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)體系，嚴(yán)重制約了滾山珠藥材的合理開發(fā)和廣泛利用[3,4]。

指紋圖譜是基于對物質(zhì)群整體作用的認(rèn)識，借助于波譜或色譜等技術(shù)獲得的中藥化學(xué)成分的波譜或色譜圖，是實現(xiàn)鑒別產(chǎn)品真實性、評價質(zhì)量一致性和產(chǎn)品穩(wěn)定性的可靠手段[5,6,7]。因此，本研究采用HPLC法建立了滾山珠指紋圖譜，并進(jìn)行相似度評價，通過聚類分析[8,9](cluster analysis，CA)、主成分分析[10,11](principal component analysis，PCA)及正交偏最小二乘-判別分析[12,13](orthogonal partial least squares analysis，OPLS-DA)等化學(xué)模式識別方法，篩選出引起不同批次滾山珠成分差異的主要標(biāo)志性成分，旨在為苗藥滾山珠的質(zhì)量控制及進(jìn)一步研究提供參考[14,15]。

1 儀器與材料

1.1 儀器

DIONEX Ultimate300 高相液相色譜儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；KQ-300DE 型數(shù)控超聲波清洗器(昆明市超聲儀器有限公司)；明澈TM-D24UV純水/超純水系統(tǒng)(法國Millipore公司)；XS-105DU 十萬分之一和AL204萬分之一電子分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)。

1.2 材料

酪氨酸對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：140609-201513)；甲醇、乙腈(購于美國TEDIA公司)均為色譜純；食用酒精(購于貴州凱鑫工貿(mào)有限公司)為食品級；水為超純水；其余試劑均為分析純。滾山珠藥材自采于貴州省各地區(qū)或購于安徽、四川、廣西、云南、海南等地，經(jīng)貴州省生物研究所陳會明副研究員鑒定為澤馬陸科動物黔鋸刺馬陸的全體Prionobelumqianensis的干燥全蟲。具體信息見表1。

表1 24批藥材來源信息Table 1 Source information of 24 batches of medicinal materials

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

取滾山珠藥材粉末(過60目篩)1.0 g，精密稱定，加70%食用酒精15 mL，超聲提取30 min，過濾，濾液濃縮蒸干，用甲醇定容至10 mL，過0.45 μm微孔濾膜，并置于4 ℃冰箱冷藏備用。

2.2 對照品溶液的制備

取酪氨酸對照品適量，精密稱定，加水制成濃度為27.1 μg/mL的對照品溶液，并置于4 ℃冰箱冷藏備用。

2.3 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱(250×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇(A)-0.1%乙酸水(B)，梯度洗脫(0～15 min，1%→2% A；15～25 min，2%→8% A；25～30 min，8%→14% A；30～35 min，14%→25% A；35～47 min，25%→65% A；47～70 min，65%→85% A)；檢測波長：254 nm；流速：0.8 mL/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：2 μL。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度實驗

精密吸取滾山珠供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，以4號酪氨酸色譜峰為參照峰(S)，計算得到各共有峰的相對保留時間的RSD<0.32%，相對峰面積的RSD<1.16%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗

取滾山珠供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件，分別在0、4、8、16、24、36 h進(jìn)樣測定，以4號酪氨酸色譜峰為參照峰(S)，計算得到各共有峰的相對保留時間的RSD<0.43%，相對峰面積的RSD<1.31%，表明供試品溶液在36 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗

取同一批滾山珠樣品6份，每份1.0 g，精密稱定，按“2.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件進(jìn)樣測定，以4號酪氨酸色譜峰為參照峰(S)，計算得到各共有峰的相對保留時間的RSD<0.52%，相對峰面積的RSD<1.56%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5 指紋圖譜建立

分別取24批滾山珠各1.0 g，按“2.1”項下方法制備樣品溶液，按“2.3”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄各色譜圖。采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)”對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以S1號樣品的色譜圖為參照圖譜，時間窗寬度為0.1 min中位數(shù)法生成對照圖譜R，經(jīng)多點校正后進(jìn)行色譜峰匹配，建立24批樣品的疊加圖譜及對照圖譜，標(biāo)定22個共有峰，經(jīng)與對照品比對，確定4號色譜峰為酪氨酸(見圖1～3)。指紋圖譜的共有峰保留時間及峰面積見表2。

圖1 24批藥材的HPLC疊加指紋圖譜Fig.1 HPLC superposed fingerprints of 24 batches of medicinal materials

圖2 藥材HPLC對照指紋圖譜Fig.2 HPLC control fingerprints of medicinal materials

圖3 酪氨酸對照品溶液的HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of tyrosine reference

2.6 相似度評價

相似度評價采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)”對24批滾山珠的HPLC指紋圖譜進(jìn)行相似度評價，結(jié)果見表3。24批滾山珠指紋圖譜的相似度除花溪S8在0.739以外，其余均在0.844～0.957之間，表明24批樣品間差異較小。

2.7 聚類分析

運(yùn)用SPSS.26軟件，采用組間聯(lián)結(jié)法，以平方歐式距離為測度對24批滾山珠樣品進(jìn)行聚類分析(見圖4)。24批樣品聚為3類：第一類是S1、S3、S4、S5、S15、S16、S19、S20，它們來自2020年于貴州省以外的各省采購的樣品；第二類是S8，它是來自2018年采集于貴州省花溪區(qū)；第三類是S2、S6～S7、S9～S14、S17～S18、S21～S24，它們除S9、S24以外都是來自2015～2016年間在貴州省內(nèi)各地采集的。聚類分析結(jié)果表明各批次總體差異性較小，其差異性表現(xiàn)出明顯的地域差異性，可能與其生長環(huán)境、生長年限和氣候條件等有關(guān)，但具體原因有待進(jìn)一步研究。

圖4 24批藥材樣品的聚類分析Fig.4 Cluster analysis of 24 batches of medicinal materials

2.8 主成分分析

以共有峰的相對峰面積為變量，利用SPSS26軟件對24批樣品進(jìn)行主成分分析，計算相關(guān)矩陣的特征值及其方差貢獻(xiàn)率[11]。以特征值>1為提取標(biāo)準(zhǔn)，得到了前5個主成分的累積方差貢獻(xiàn)率為89.063%，能夠較好的代表指紋圖譜中的大部分信息，結(jié)果見表4。從成分載荷矩陣表可以看出，第一主成分的獨立方差貢獻(xiàn)率為43.640%，主要反映色譜峰1～5、8、11、12、13、17、18、20、21的信息；第二主成分的獨立方差貢獻(xiàn)率為20.679%，主要反映色譜峰6、7、9、10、14～16的信息；第三主成分的獨立方差貢獻(xiàn)率為10.762%，主要反映色譜峰4、6、19的信息；第四主成分的獨立方差貢獻(xiàn)率為9.235%，主要反映色譜峰22的信息；第五主成分的獨立方差貢獻(xiàn)率為4.748%，主要反映色譜峰1的信息。

表4 24批藥材主成分特征值及方差貢獻(xiàn)率Table 4 Characteristic value and variance contribution rate of 24 batches of medicinal materials

利用SIMCA 14.1軟件計算主成分得分(見圖5)。結(jié)果表明24批藥材可大致分為三類，S1、S3、S4、S5、S15、S16、S19、S20為第一類；S8為第二類；S2、S6、S7、S9～S14、S17、S18、S21～S24為第三類，其結(jié)果與聚類分析結(jié)果一致。

圖5 24批藥材主成分分析得分Fig.5 Score of principal component analysis of 24 batches of medicinal materials

2.9 正交偏最小二乘判別分析

采用SIMCA 14.1軟件對各樣品共有峰峰面積進(jìn)行正交偏最小二乘判別分析，結(jié)果見圖6。不同批次樣品可聚為3類，與聚類分析和主成分分析結(jié)果一致。提取模型中的22個變量的VIP值(見圖7)，變量重要性投影值(VIP)是篩選差異性化合物的重要指標(biāo)，VIP值越高，對組間差異的影響越大[16]。以VIP>1為閾值，色譜峰從大到小分別為17號峰(VIP=3.155 9)、2號峰(VIP=1.459 1)、1號峰(VIP=1.437 8)、12號峰(VIP=1.032 5)、11號峰(VIP=1.020 7)，表明這5個色譜峰是影響滾山珠藥材間質(zhì)量差異的主要標(biāo)志性成分，在之后的研究中應(yīng)多關(guān)注這幾個成分。

圖6 24批藥材正交偏最小二乘判別分析得分Fig.6 Score of orthogonal partial least squares discriminant analysis for 24 batches of medicinal materials

圖7 藥材的正交偏最小二乘判別分析VIP值Fig.7 VIP value of orthogonal partial least squares discriminant analysis

3 討論

3.1 色譜條件優(yōu)化

試驗前期考察了甲醇、乙腈洗脫系統(tǒng)對色譜峰分離效果的影響，結(jié)果顯示甲醇為流動相時分離效果較好，且基線平穩(wěn)；考察了甲醇-0.1%甲酸水和甲醇-0.1%乙酸水的分離效果，最終選擇分離效果較好的甲醇-0.1%乙酸水系統(tǒng)；分析了210～400 nm處全波長掃描的圖譜，顯示在254 nm下出峰數(shù)量多，基線平穩(wěn)，信號響應(yīng)值大；通過考察不同流速(0.8、1.0、1.2 mL/min)、柱溫(25、30、35、40 ℃)對色譜峰的影響，確定選擇流速為0.8 mL/min，柱溫25 ℃。

3.2 供試品溶液制備方法優(yōu)化

試驗前期考察了超聲和回流2種提取方式，發(fā)現(xiàn)其提取效率無明顯差別，故選擇操作較簡單的超聲提??；比較了水、甲醇、食用酒精作為提取溶劑，結(jié)果顯示，食用酒精提取時色譜峰數(shù)目多、響應(yīng)值較大。并比較不同濃度食用酒精(30%、50%、70%、90%)的提取效果，結(jié)果表明，70%食用酒精提取時色譜峰響應(yīng)值較大。綜合考慮，選用70%食用酒精超聲提取作為供試品溶液的制備方法。

3.3 小結(jié)

本研究首次建立了苗藥滾山珠的指紋圖譜，24批樣品指紋圖譜的相似度在0.739～0.957，指認(rèn)了1個成分。通過化學(xué)模式識別分析，建立了滾山珠的聚類分析、主成分分析和正交偏最小二乘判別分析的分類模型，明確了樣品之間的歸類情況。24批樣品聚為3類，篩選得到影響滾山珠藥材間質(zhì)量差異的5個主要標(biāo)志性成分。

綜上所述，本研究建立的HPLC指紋圖譜方法穩(wěn)定、可靠、重復(fù)性好，可為苗藥滾山珠藥材的質(zhì)量控制提供參考。