后海穴3種針術(shù)對(duì)便秘大鼠腸神經(jīng)遞質(zhì)的影響

王海燕，李 碩，馬愛(ài)團(tuán) (河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 中獸醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071001)

便秘是獸醫(yī)臨床常見(jiàn)病，西醫(yī)治療常用莫沙必利，該藥為5-羥色胺4受體(5-HT4R)激動(dòng)劑，通過(guò)刺激胃腸運(yùn)動(dòng)，改善胃腸道癥狀，但長(zhǎng)期使用效果并不理想。針灸治療便秘療效確切，且復(fù)發(fā)性低[1]。后海穴(GV-1)是獸醫(yī)臨床治療便秘的主要穴位[2]，GV-1位于動(dòng)物尾根與肛門(mén)之間，操作方便，各種針術(shù)(如白針、火針、水針、電針及激光針)均有相關(guān)報(bào)道[3-5]。但是不同針術(shù)的療效比較及其相應(yīng)的作用途徑和機(jī)理尚不明確。

血管活性腸肽(VIP)作用于平滑肌，可影響胃腸黏膜分泌液體；存在腸肌間神經(jīng)叢的P物質(zhì)(SP)調(diào)控胃腸道運(yùn)動(dòng)；5-羥色胺(5-HT)是腸神經(jīng)系統(tǒng)中重要介質(zhì)[6]，與不同受體結(jié)合產(chǎn)生不同作用。在胃腸道中，5-羥色胺3受體(5-HT3R)主要分布于平滑肌細(xì)胞、腸神經(jīng)元、迷走神經(jīng)和脊髓初級(jí)傳入神經(jīng)元[7]，在突觸間隙與5-HT結(jié)合后，引起神經(jīng)遞質(zhì)的分泌和釋放增加。5-HT4R主要分布于平滑肌細(xì)胞和腸神經(jīng)元中[8]，參與蠕動(dòng)反射，激活后也可導(dǎo)致中間神經(jīng)元與運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元釋放乙酰膽堿，從而促進(jìn)胃腸運(yùn)動(dòng)[9]。CHEN等[10]研究證實(shí)5-HT重?cái)z取轉(zhuǎn)運(yùn)體(SERT)基因敲除的小鼠出現(xiàn)的水樣瀉，可能是增強(qiáng)了5-HT信號(hào)通路的作用，而便秘的發(fā)生是由于5-HT過(guò)度釋放導(dǎo)致5-HT受體不敏感。

本試驗(yàn)應(yīng)用后海穴，選擇臨床常用的白針、水針和埋線，通過(guò)鹽酸洛哌丁胺建立便秘模型，比較3種針術(shù)對(duì)便秘的治療效果，明確不同針術(shù)對(duì)便秘大鼠腸道傳輸功能的影響，同時(shí)探索不同針術(shù)對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)的作用以及對(duì)5-HT信號(hào)途徑的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物成年清潔級(jí)SD大鼠60只，購(gòu)自北京斯貝福有限公司。

1.2 藥物鹽酸洛哌丁胺膠囊(2 mg/粒，西安楊森制藥有限公司)，枸櫞酸莫沙必利分散片(5 mg/片，浙江京新藥業(yè)股份有限公司)，VB12，速眠新。

1.3 主要試劑TB Green Premix ExTaqTM熒光定量試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司，5-HT3R、5-HT4R、SERT定量PCR引物購(gòu)自北京六合通經(jīng)貿(mào)有限公司，總RNA提取試劑盒、SP、VIP、5-HT ELISA試劑盒購(gòu)自北京普洛麥格生物技術(shù)有限公司。

1.4 模型制備飼養(yǎng)條件為室溫22～24℃，濕度50%～60%，12 h交替照明，大鼠自由飲食。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，體質(zhì)量為(215±10)g，抽簽隨機(jī)分為A～F組，分別為對(duì)照組、模型組、西藥組、白針組、水針組、埋線組。參照文獻(xiàn)[11]的方法復(fù)制便秘大鼠模型，除對(duì)照組灌服生理鹽水外，其余5組均予鹽酸洛哌丁胺混懸液灌胃3 mg/(kg·d)，每天上午1次，直至試驗(yàn)結(jié)束。

1.5 動(dòng)物處理在上述模型制備基礎(chǔ)上，每天下午進(jìn)行不同處理，連續(xù)7 d。由圖1可見(jiàn)，其中對(duì)照組和模型組在大腿內(nèi)側(cè)肝經(jīng)和腎經(jīng)循行路線之間的非穴位處(該部位穴位較少，遠(yuǎn)離脾經(jīng)和胃經(jīng))進(jìn)行白針刺激。西藥組用莫沙必利(蒸餾水配成1 g/L懸濁液)1.3 mg/(kg·d)灌胃。白針組在后海穴(尾根和肛門(mén)之間的凹陷)用0.25 mm×25 mm一次性針灸針(北京中研太和醫(yī)療器械有限公司)刺入穴位，維持20 min，每10 min進(jìn)行1次捻轉(zhuǎn)提插行針，針刺后大鼠放回鼠籠，維持自然放松狀態(tài)。水針組在后海穴注射0.1 mL VB12。埋線組將0.2 mm酒精浸泡消毒的可吸收羊腸線埋入后海穴。除埋線組單次治療外，其他各組每天1次。

A.白針；B.水針；C.埋線圖1 動(dòng)物處理

1.6 指標(biāo)檢測(cè)

1.6.1腸道傳輸功能檢測(cè)與糞便數(shù)量的比較 動(dòng)物處理7 d后，收集各組大鼠的糞便進(jìn)行計(jì)數(shù)。禁食24 h后，墨汁2 mL/只灌胃，20 min后肌肉注射速眠新0.08 mL/kg，開(kāi)腹分離腸系膜暴露腸管，剪取幽門(mén)至回盲部腸管，輕輕拉成直線，測(cè)量小腸總長(zhǎng)及墨汁在小腸的推進(jìn)長(zhǎng)度，計(jì)算各組墨汁在小腸的推進(jìn)率。

墨汁推進(jìn)率=墨汁推進(jìn)長(zhǎng)度/小腸總長(zhǎng)度×100%。

1.6.2結(jié)腸組織中5-HT、SP、VIP的含量 釆集各組大鼠結(jié)腸組織，生理鹽水沖洗腸道，置于-80℃保存，利用ELISA試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)腸組織中5-HT，SP，VIP的含量。

1.6.3Q-PCR測(cè)定結(jié)腸組織中5-HT3R，5-HT4R，SERT mRNA的含量 使用總RNA提取試劑盒從結(jié)腸中提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。通過(guò)實(shí)時(shí)定量熒光PCR方法檢測(cè)結(jié)腸中5-HT3R，5-HT4R，SERT的mRNA轉(zhuǎn)錄水平，引物由TaKaRa設(shè)計(jì)合成(表1)。預(yù)變性處理為95℃ 30 s，擴(kuò)增進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，包括95℃ 5 s，60℃ 30 s。內(nèi)參基因?yàn)棣?actin，由2-ΔΔCt計(jì)算每個(gè)基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平。

表1 實(shí)時(shí)定量 PCR引物信息

2 結(jié)果

2.1 大鼠表現(xiàn)與空白組大鼠相比，模型組大鼠出現(xiàn)食欲下降，糞便顆粒減少、便粒黑小、沒(méi)有光澤，精神不振、活動(dòng)度下降，毛色無(wú)光。3個(gè)針刺組及西藥組大鼠的表現(xiàn)比模型組均有所好轉(zhuǎn)，進(jìn)食量及活動(dòng)度增加、皮毛有光澤、排便增多、糞便顆粒增大、有一定光澤度。各組糞粒比較見(jiàn)圖2。

A.對(duì)照組；B.模型組；C.西藥組；D.白針組；E.水針組；F.埋線組圖2 大鼠20粒糞便長(zhǎng)度比較

2.2 大鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)各組大鼠結(jié)腸黏膜完整，未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，黏膜上皮層細(xì)胞呈單層柱狀，細(xì)胞排列整齊。A組固有層腸腺結(jié)構(gòu)完整，腸腺長(zhǎng)而直，有腸腔，腺上皮有杯狀細(xì)胞(黑色箭頭所指)，且分布均勻，細(xì)胞形態(tài)完整；B組固有層少量腸腺結(jié)構(gòu)不完整，杯狀細(xì)胞破損或消失，細(xì)胞基質(zhì)增大；C～F組固有層杯狀細(xì)胞與腸腺結(jié)構(gòu)清晰完整，細(xì)胞基質(zhì)均勻(圖3)。

A.對(duì)照組；B.模型組；C.西藥組；D.白針組；E.水針組；F.埋線組；黑色箭頭.杯狀細(xì)胞;紅色箭頭.腸腺圖3 3種針術(shù)對(duì)大鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)的影響(400×)

2.3 大鼠糞粒數(shù)量與小腸推進(jìn)率模型組小腸推進(jìn)率顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，白針、水針與埋線3組均提高小腸推進(jìn)率，達(dá)到西藥組水平，與對(duì)照組無(wú)顯著性差異。

與對(duì)照組比較，模型組大鼠的糞便粒數(shù)減少29.5%；與模型組相比，西藥組提高23.2%，白針組提高18.7%，水針組提高31.3%，埋線組提高25.9%，以水針組最佳(表2)。

表2 3種針術(shù)對(duì)便秘大鼠小腸推進(jìn)率和糞便粒數(shù)的影響

2.4 3種針術(shù)對(duì)大鼠結(jié)腸組織中神經(jīng)遞質(zhì)的影響對(duì)于結(jié)腸組織中VIP、SP、5-HT的水平，由表3結(jié)果可見(jiàn),與對(duì)照組比較，模型組SP降低40.6%，有極顯著性差異(P<0.01)；與模型組相比，西藥組、白針組、水針組和埋線組均上調(diào)SP的水平，分別提高55.0%，40.6%，58.5%，60.6%，其中水針組與埋線組效果最佳，優(yōu)于西藥組。與對(duì)照組比較，模型組結(jié)腸組織中VIP的水平有極顯著性差異(P<0.01)；與模型組相比，西藥組、白針組、水針組和埋線組均下調(diào)VIP的水平，分別降低26.4%，23.5%，14.7%，25.4%，白針組和埋線組效果可達(dá)到西藥組效果。模型組結(jié)腸組織中5-HT水平顯著高于對(duì)照組(P=0.012)；與模型組比較，西藥組和埋線組可顯著下調(diào)5-HT水平(P=0.014和0.021)。

表3 3種針術(shù)對(duì)便秘大鼠腸道組織5-HT、SP 、VIP水平的影響

2.5 3種針術(shù)對(duì)大鼠結(jié)腸組織中5-HT3R、5-HT4R、SERT mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織中5-HT3R、5-HT4R、SERT mRNA的轉(zhuǎn)錄水平均呈下降趨勢(shì)(P<0.01)，各治療組的轉(zhuǎn)錄水平上升(P<0.01或P<0.05)，3個(gè)針刺組的5-HT3R轉(zhuǎn)錄水平與西藥組無(wú)顯著性差異，其中埋線組最佳；同時(shí)各針刺組SERT的轉(zhuǎn)錄水平優(yōu)于對(duì)照組(P分別為0.126，0.064，0.047)，以埋線效果最佳；埋線組的5-HT4R轉(zhuǎn)錄水平顯著高于C、D、E組(P分別為0.006，0.004，0.015)(圖4)。

圖4 3種針術(shù)對(duì)結(jié)腸組織5-HT3R(A)、5-HT4R(B)、SERT(C) 表達(dá)水平的影響

3 討論

便秘是動(dòng)物臨床常見(jiàn)疾病，嚴(yán)重降低動(dòng)物的生活質(zhì)量。GV-1是督脈的起始穴位，同時(shí)是肛門(mén)、陰門(mén)的局部穴位。研究表明，GV-1廣泛治療各種動(dòng)物消化系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)的疾病[12-15]。研究證實(shí)，針刺GV-1可上調(diào)腹瀉家兔血漿VIP含量，下調(diào)SP含量[16]，有效緩解腹瀉，同時(shí)針刺GV-1還廣泛治療動(dòng)物便秘[17]，因此GV-1具有雙向調(diào)節(jié)作用，治療多種消化系統(tǒng)疾病。

本研究結(jié)果顯示，3種針術(shù)均可改善腸道傳輸功能，有效緩解便秘。針刺后結(jié)腸組織中VIP 含量較模型組大鼠顯著下降，以水針效果最佳；而SP含量較模型組明顯升高，以埋線組效果最佳，與西藥組有顯著性差異。已有研究表明，便秘的發(fā)病機(jī)制與胃腸神經(jīng)遞質(zhì)的改變有關(guān)[18]，針灸治療便秘可有效改善結(jié)腸動(dòng)力[19-20]。SP 能有效促進(jìn)腸道平滑肌的收縮，并可刺激腸道黏膜分泌水和電解質(zhì)，從而促進(jìn)胃腸蠕動(dòng)[21]。VIP 是一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，其參與腸道舒張，調(diào)節(jié)腸道水液代謝，降低結(jié)腸和直腸的緊張性[22]，本試驗(yàn)證實(shí)，3種針術(shù)均可調(diào)節(jié)結(jié)腸組織中SP和VIP水平，改善腸道功能。

實(shí)時(shí)定量熒光PCR結(jié)果表明，與模型組相比，3種針刺方法均上調(diào)5-HT3R、5-HT4R、SERT轉(zhuǎn)錄水平，與西藥組無(wú)顯著性差異，但不同針刺方法的結(jié)果有一定差異。埋線是在傳統(tǒng)針灸的基礎(chǔ)上進(jìn)行的改良和延伸，研究證實(shí)埋植羊腸線對(duì)穴位進(jìn)行持續(xù)刺激，進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體的內(nèi)分泌系統(tǒng)，促進(jìn)胃腸運(yùn)動(dòng)以達(dá)到通便作用[23]。本試驗(yàn)GV-1埋線顯著調(diào)節(jié)5-HT在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)。5-HT 在腸道運(yùn)動(dòng)、分泌和感覺(jué)功能中起著重要作用[24]，有研究表明便秘發(fā)病原因與5-HT信號(hào)通路改變有關(guān)[25]。對(duì)便秘小鼠進(jìn)行穴位電針，能夠上調(diào)5-HT3R、5-HT4R、SERT的mRNA轉(zhuǎn)錄水平，調(diào)節(jié)便秘[26]，本試驗(yàn)結(jié)果與報(bào)道一致，通過(guò)針刺調(diào)節(jié)5-HT信號(hào)通路的異常，SERT的表達(dá)上升，5-HT重?cái)z取速度加快，降低結(jié)腸作用于5-HT受體的5-HT含量，提高了5-HT受體表達(dá)。

綜上，水針、白針和埋線均能緩解便秘癥狀，改善腸道組織結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)腸道運(yùn)動(dòng)和神經(jīng)遞質(zhì)的含量。其中，水針與埋線效果更佳，推測(cè)水針發(fā)揮了針和藥的協(xié)同作用；埋線可以長(zhǎng)期刺激穴位，同時(shí)對(duì)大鼠的應(yīng)激反應(yīng)較小。