馬泰勒蟲頂膜抗原1基因的原核表達與鑒定

范士龍，劉丹丹，韋麗婷，蘆 星，李思媛，王金明，呼爾查，李永暢，巴音查汗，張 偉 (新疆農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學學院，新疆 烏魯木齊 830052)

馬泰勒蟲(Theileriaequi)是一種由硬蜱傳播，寄生于馬屬動物的紅細胞及網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)細胞內(nèi)的頂復門血液原蟲，與馬駑巴貝斯蟲(Babesiasiscaballi)同屬于馬梨形蟲范疇[1-2]。馬泰勒蟲病的臨床癥狀主要為稽留熱、貧血、黃疸等[3]，其主要臨床特點為急性溶血性貧血[4]。孕馬感染此病易引起早產(chǎn)或流產(chǎn)，嚴重時會導致死亡[3]，對畜牧業(yè)的生產(chǎn)和發(fā)展造成嚴重影響。目前世界動物衛(wèi)生組織(OIE)已將該病列入動物疫病名錄，屬法定報告疫病，在我國該病被列為二類動物疫病[5]。目前對于該病尚無十分有效的藥物和疫苗，因此如何有效預防和控制馬泰勒蟲病、減少其危害是相關(guān)領(lǐng)域研究的熱點。

頂復門原蟲的頂膜抗原1(apical membrane antigen 1，AMA1)是一種由微線體分泌的高度保守蛋白的Ⅰ型跨膜蛋白，包括N端氨基端富半胱氨酸胞外區(qū)、單一跨膜結(jié)構(gòu)域以及C端羧基末端細胞質(zhì)尾巴三部分[6]。對于頂復門原蟲AMA1蛋白的研究，戚南山等[7]主要關(guān)注該蛋白與RONs(棒狀體頸部蛋白)家族蛋白相互結(jié)合形成復合連接體后，參與到蟲體入侵宿主細胞的過程；以及KOCKEN等[8]將該蛋白作為候選抗原制備疫苗預防頂復門原蟲的感染。目前AMA1蛋白在弓形蟲(Toxoplasma)、瘧原蟲(Plasmodium)、巴貝斯蟲(Babesia)、球蟲(Eimeria)等頂復門原蟲中均有發(fā)現(xiàn)，并且在柔嫩艾美耳球蟲(Eimeriatenella)、剛地弓形蟲(Txoplasmagondii)和間日瘧原蟲(Plasmodiumvivax)中均被證實參與到蟲體對宿主的入侵過程中[7]。在梨形蟲中，目前僅有研究證明田鼠巴貝斯蟲(Babesiamicroti)和分歧巴貝斯蟲(Babesiadivergens)的AMA1蛋白參與了宿主入侵過程[9-10]。然而，AMA1蛋白在泰勒蟲中是否存在并參與宿主細胞入侵尚未見報道。

為了探究AMA1蛋白在馬泰勒蟲中是否參與了宿主細胞入侵過程，本研究首先以擴增馬泰勒蟲AMA1基因并獲得穩(wěn)定表達蛋白為目標。以馬泰勒蟲新疆株為研究對象，在擴增出馬泰勒蟲新疆株AMA1基因序列后，對AMA1重組蛋白進行表達和鑒定。研究結(jié)果為進一步探究馬泰勒蟲AMA1蛋白與RONs蛋白的互作關(guān)系，進而解析馬泰勒蟲入侵宿主機制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑馬泰勒蟲陽性抗凝馬全血采自新疆塔城地區(qū)。pMD19-T載體、pGEX-4T-1載體、T4DNA連接酶，E.coliDH5α、E.coliBL21、Xho Ⅰ、EcoR Ⅰ、Taq DNA聚合酶、dNTP、Agarose Gel DNA Extraction Kit、DNA Marker、蛋白質(zhì)Marker等均購自寶生物工程(大連)有限公司；DNA片段純化回收試劑、質(zhì)粒小量提取試劑盒購自O(shè)MEGA生物試劑公司；血液/組織 DNA 提取試劑盒、Prime STAR Max Premix(2×)、ELC顯色試劑盒購自康為世紀生物科技有限公司;辣根過氧化物酶(HRP)標記的兔抗馬IgG購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.2 引物設(shè)計與合成用GenBank公布的Theileriaequistrain WA(XM_004833042.1) AMA1基因序列為模板BLAST NC_025260.1Theileriaorientalis；NW_001091929.1Theileriaannulata；NC_007344.1Theileriaparva基因組數(shù)據(jù)，以獲得的泰勒蟲屬AMA1保守基因序列為模板，用 Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計特異性引物(表1)，送生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 AMA1基因引物信息

1.3 AMA1基因擴增與克隆按照DNA提取試劑盒說明書，提取馬泰勒蟲基因組DNA。以基因組DNA為模板進行PCR擴增，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后與克隆載體pMD19-T連接，轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α感受態(tài)細胞，37℃過夜培養(yǎng)，將PCR鑒定為陽性的轉(zhuǎn)化子送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

1.4 AMA1基因序列遺傳進化分析利用MEGA 7.0軟件分析馬泰勒蟲新疆株與其他頂復門原蟲AMA1基因的核苷酸序列，構(gòu)建Maximum parsimany(MP)系統(tǒng)發(fā)生樹，分析以AMA1基因為標記的頂復門原蟲分類進化關(guān)系。

1.5 pGEX-4T-AMA1重組質(zhì)粒構(gòu)建分別提取陽性克隆和表達載體pGEX-4T-1質(zhì)粒DNA，分別用EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ進行雙酶切，酶切后產(chǎn)物進行連接，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coliBL21感受態(tài)細胞內(nèi)，提取質(zhì)粒DNA，進行PCR和酶切鑒定。將鑒定為陽性的菌液送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.6 重組蛋白的誘導表達及可溶性分析將測序正確的重組菌液100 μL接種到20 mL 含有氨芐抗性LB培養(yǎng)基內(nèi)，37℃培養(yǎng)，待菌液培養(yǎng)至D值達到0.6時，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG進行誘導表達，分別于0，1，2，3，4，5，6 h取1 mL菌液留樣；加入終濃度分別為0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mmol/L的誘導劑，誘導一定時間取樣。12 000 r/min離心1 min收集菌體，制樣進行SDS-PAGE分析。

根據(jù)優(yōu)化的最佳表達時間和誘導劑濃度進行擴大培養(yǎng)。誘導表達菌液離心棄上清液后，用PBS重懸，8 000 r/min離心5 min，清洗3遍，冰浴超聲破碎菌體(工作5 s，間歇6 s)，破碎10 min。破碎后的菌液經(jīng)8 000 r/min離心30 min，分別收集上清液和沉淀制樣，經(jīng)SDS-PAGE分析，判斷表達產(chǎn)物存在形式。

1.7 重組蛋白Western blot鑒定向蛋白膠孔內(nèi)每孔加入8 μL重組蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳后，濕轉(zhuǎn)于PVDF上，用封閉液(5%脫脂乳，含0.5% Tween的PBS稀釋)4℃過夜封閉，使用馬泰勒蟲陽性血清作為一抗(1∶100)，以HRP標記的兔抗馬IgG用5%脫脂乳1∶5 000稀釋作為二抗，使用ELC超敏顯色液避光孵育1 min，進行Western blot 分析。

2 結(jié)果

2.1 馬泰勒蟲AMA1基因的克隆與鑒定以馬泰勒蟲pMD19-T-AMA1菌液為模板，經(jīng)PCR擴增后獲得大小約為1 007 bp目的片段(圖1)，將陽性菌液進行測序，序列比對結(jié)果顯示，與GenBank收錄的馬泰勒蟲美國WA株AMA1基因(XM_004833042.1)核苷酸和氨基酸同源性分別為76.34%和78.64%，序列已上傳至GenBank(NCBI登錄號：MW346657)。

M.DL15000 DNA Marker；1，2.AMA1菌液PCR產(chǎn)物圖1 pMD-19T-AMA1菌液鑒定結(jié)果

2.2 AMA1基因的系統(tǒng)發(fā)生樹構(gòu)建利用MEGA 7.0軟件，以頂復門原蟲AMA1基因為分子標記，以核苷酸序列構(gòu)建MP系統(tǒng)發(fā)生樹(圖2)。結(jié)果顯示，以AMA1基因為標記的進化樹聚類關(guān)系符合物種分類，其中馬泰勒蟲新疆株被聚類到泰勒蟲屬，與馬泰勒蟲美國WA株位于同一支，兩者進化關(guān)系最為接近，表明AMA1基因可以作為頂復門原蟲種屬鑒定的一個依據(jù)。

圖2 以AMA1基因為分子標記構(gòu)建的11種頂復門原蟲系統(tǒng)發(fā)生樹

2.3 pGEX-4T-AMA1重組質(zhì)粒構(gòu)建將測序正確的重組pGEX-4T-AMA1質(zhì)粒進行雙酶切鑒定。用EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ對重組質(zhì)粒進行酶切后，獲得約為4 900，927 bp的2條目的片段(圖3)，表明目的基因片段成功插入到原核表達載體中。

M.DL15000 DNA Marker；1.質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物；2.陽性對照圖3 pGEX-4T-AMA1質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果

2.4 重組蛋白的誘導表達SDS-PAGE 分析結(jié)果顯示，以終濃度為0.8 mmol/L IPTG 37℃誘導 3 h時，蛋白表達量最高(圖4A、B)。誘導后的表達產(chǎn)物大小約為60 kDa，與其理論值基本一致。經(jīng)過超聲破碎、離心分別收集上清和沉淀，進行SDS-PAGE檢測，結(jié)果顯示重組蛋白在沉淀中表達量較高，為包涵體蛋白且條帶較為單一(圖4C)。

M.蛋白 Marker；A.重組蛋白誘導時間優(yōu)化(1.未誘導；2～7.分別誘導1，2，3，4，5，6 h，誘導劑IPTG終濃度1 mmol/L)；B.重組蛋白IPTG濃度優(yōu)化(1.未誘導；2～6. 誘導劑IPTG終濃度分別為0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mmol/L)；C.重組蛋白可溶性分析(1.誘導3 h上清；2.誘導3 h包涵體37℃ IPTG終濃度為0.8 mmol/L)圖4 重組蛋白誘導條件優(yōu)化和可溶性分析

2.5 Western blot分析取包涵體沉淀制樣，經(jīng)SDS-PAGE 電泳后濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上。結(jié)果顯示，馬泰勒蟲陽性血清與重組蛋白產(chǎn)生特異性反應(yīng)，在60 kDa處有特異性條帶出現(xiàn)(圖5)，表明該重組蛋白具有特異性和反應(yīng)原性。

M.蛋白 Marker；1.陽性圖5 重組蛋白Western blot分析結(jié)果

3 討論

隨著對頂復門原蟲AMA1蛋白研究的不斷深入，有研究表明，在蟲體侵入宿主細胞的過程中，AMA1所表現(xiàn)出特有的階段性表達和分泌現(xiàn)象，說明AMA1蛋白在入侵過程中存在著特異性表達[11-12]。MITAL等[13]嘗試敲除 AMA1，發(fā)現(xiàn)弓形蟲入侵減少。同時，惡性瘧原蟲AMA1在子孢子表達并參與入侵肝細胞后消失[14]。由此推斷，AMA1可能在頂復門原蟲入侵宿主細胞的過程中起到重要的作用[15]，截至目前，關(guān)于馬泰勒蟲AMA1蛋白及其功能的研究尚未見報道。

為了便于進一步研究馬泰勒蟲AMA1蛋白的相關(guān)功能，本研究首先獲得馬泰勒蟲新疆株AMA1基因(GenBank登錄號：MW346657)，以AMA1基因為分子標記構(gòu)建進化樹，結(jié)果表明，馬泰勒蟲新疆分離株在進化分支屬于泰勒蟲屬，與GenBank收錄的馬泰勒蟲美國WA株AMA1基因(XM_004833042.1)BLAST結(jié)果顯示，核苷酸和氨基酸同源性分別為76.34%和78.64%，進化關(guān)系最為接近。AMA1蛋白作為頂復門原蟲中高度保守的表面蛋白，存在于多種頂復門原蟲中，馬泰勒蟲也與其他頂復門原蟲一樣具有該基因，但馬泰勒蟲中的AMA1蛋白是否與其他入侵相關(guān)蛋白之間產(chǎn)生相互作用，參與到蟲體對宿主細胞的入侵過程中，還有待進一步研究。原核表達所獲得的融合蛋白AMA1相對分子質(zhì)量為60 kDa，以包涵體蛋白形式存在；Western blot分析結(jié)果表明，該重組蛋白能夠被馬泰勒蟲天然陽性血清識別，表明重組馬泰勒蟲AMA1蛋白具有較高的抗原性，同時也說明馬匹感染馬泰勒蟲后能產(chǎn)生對該蛋白較強的抗體。

AMA1在蟲體入侵宿主細胞的關(guān)鍵作用可為疫苗研發(fā)提供新思路。在頂復門原蟲中，將AMA1蛋白作為候選抗原來制備疫苗在弓形蟲、瘧原蟲和艾美爾球蟲的研究較深入。弓形蟲AMA1病毒樣顆粒誘導的免疫應(yīng)答對弓形蟲感染具有部分保護作用，為潛在的弓形蟲疫苗提供了新的設(shè)計策略[16]；同時，AMA1重組抗原還可作為交叉抗原，對弓形蟲和新孢子蟲具有免疫作用[17]。在瘧原蟲中，AMA1作為瘧原蟲紅細胞內(nèi)期最早的候選疫苗[18]，最近報道發(fā)現(xiàn)AMA1蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅱ抗體可以有效抑制惡性瘧原蟲裂殖子入侵紅細胞[19]。在雞球蟲中，AMA1的表達質(zhì)粒對雞柔嫩艾美耳球蟲感染具有一定的免疫保護力[20]。以上研究充分證明了AMA1蛋白特異性抗體對蟲體侵襲具有一定的免疫保護效果，在頂復門原蟲入侵宿主中具有重要作用。目前關(guān)于馬泰勒蟲AMA1蛋白的研究國內(nèi)外鮮有報道，還未證實馬泰勒蟲AMA1蛋白的特異性抗體是否與其他頂復門原蟲一樣，可以對宿主起到保護作用。

本研究成功獲得了馬泰勒蟲新疆株AMA1基因序列，并成功表達出相對分子質(zhì)量為60 kDa的重組蛋白，并且可以和天然陽性血清發(fā)生反應(yīng)。有望成為馬泰勒蟲的免疫診斷抗原和疫苗候選抗原，相關(guān)蛋白互作及細胞定位試驗有待于研究。本研究為探究馬泰勒蟲入侵宿主細胞的分子機制及疫苗的研制提供了理論依據(jù)，為進一步深入了解AMA1蛋白的生物學功能奠定了基礎(chǔ)。