溴硝醇液相檢測方法的研究探索

馬寶龍， 周銀輝， 魏學(xué)鑫， 顧學(xué)斌

上海萬厚生物科技有限公司，上海 201815

1919年，溴硝醇(化學(xué)鍵線式如圖1)由WILKENDORF R制得，后由英國藥學(xué)協(xié)會公布其通用名為Bronopol。該物質(zhì)作為殺菌劑主要應(yīng)用于工業(yè)循環(huán)水、造紙紙漿、涂料、化妝品、木材、冷卻水循環(huán)系統(tǒng)以及其他領(lǐng)域包括農(nóng)業(yè)在內(nèi)的殺菌、防腐及防藻[1]。

圖1 溴硝醇化學(xué)結(jié)構(gòu)

溴硝醇在工業(yè)生產(chǎn)體系中，大多數(shù)的有機(jī)物、各種表面活性劑或低濃度蛋白都不會影響其活性，且彼此無拮抗作用。當(dāng)25%甲基異噻唑啉酮和75%溴硝醇復(fù)配時，其殺菌協(xié)同作用顯著。室內(nèi)人工感染預(yù)防實驗和治療實驗對這一結(jié)果進(jìn)行了驗證。試驗結(jié)果表明，溴硝醇和異噻唑啉酮配比為4∶1的復(fù)方制劑，其預(yù)防作用及治療作用均優(yōu)于單劑[2]。

目前，關(guān)于溴硝醇復(fù)配制劑利用高效液相色譜測定其含量的方法未見相關(guān)報道，本實驗采用的方法能夠在較短時間完成對溴硝醇原料及其制劑的定量檢測，該方法的重現(xiàn)性、精密度、回收率都可以達(dá)到定量分析的要求。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備

液相色譜儀：賽默飛高效液相色譜儀u3000配有紫外檢測器；工作站：變色龍工作站7.2.7版本；色譜柱：Phenomenex Kinetex C18不銹鋼柱(250 mm×4.6 mm)；流動相抽濾裝置。

1.2 試劑

甲醇：色譜純；磷酸：色譜純；純凈水；溴硝醇標(biāo)樣(含量為99.46%)，市售；待測樣品A(溴硝醇+卡松)，萬厚生物提供；待測樣品B(溴硝醇+OIT)，萬厚生物提供。待測樣品C(溴硝醇+溶劑)。

1.3 操作條件

色譜柱: Phenomenex Kinetex C18柱或同等;檢測器波長:215 nm;柱溫:40 ℃;流動相:甲醇∶0.05%磷酸水溶液(v/v)=15∶85; 流速:1.0 mL/min。溴硝醇保留時間約為7.1 min。

1.4 實驗步驟

1.4.1稱取配制

標(biāo)樣: 先用稱量紙精確稱取0.010 g(精確到0.001 g，實際稱取質(zhì)量為m1)含量為99.46%的標(biāo)準(zhǔn)溴硝醇標(biāo)樣粉末。將100 mL的潔凈帶蓋塑料瓶中置于電子天平上，清零，然后加入標(biāo)樣及流動相稀釋到100.0 g(精確到0.001 g，實際稀釋后總質(zhì)量為m2)，超聲分散至原料完全溶解,震蕩混勻，靜置3 min待用。

待檢溴硝醇原料: 用稱量紙精確稱取0.010 g(精確到0.001 g，實際稱取質(zhì)量為m3)待測樣。將100 mL的帶蓋塑料瓶中置于天平上。清零，然后加入待測樣及流動相稀釋到100.0 g(精確到0.001 g，實際稱取質(zhì)量為m4)，超聲分散至原料完全溶解,震蕩混勻，靜置3 min待用。

1.4.2液相穩(wěn)定

打開液相色譜儀前先將流動相超聲過濾，然后打開液相色譜儀將參數(shù)設(shè)置好，打開氘燈，穩(wěn)定30 min，等基線平穩(wěn)，壓力穩(wěn)定后，記下壓力值，然后進(jìn)行試驗。

1.4.3進(jìn)樣

先進(jìn)甲醇清洗進(jìn)樣器，試運行一針空白甲醇。再將進(jìn)樣針用甲醇清洗干凈，然后再用標(biāo)樣清洗(次數(shù)不少于3次)，最后吸取100 μL的標(biāo)樣，快速注入樣品閥中(Load位置)，然后快速將閥門打到Inject位置，進(jìn)行分析。每針運行時間不少于14 min。連續(xù)進(jìn)兩針標(biāo)樣，檢定兩次檢出峰面積偏差小于2.0%以后，再進(jìn)行待檢樣品的測定。待測樣品測定至少進(jìn)行兩次。

1.4.4結(jié)果計算

從圖2可以看到有一個峰為主要峰即為溴硝醇。將主要峰的保留時間，峰面積記錄下來。譜圖分析要自動標(biāo)峰，本特定儀器標(biāo)定色譜峰起點和終點的斜率設(shè)定為1 000(推薦值，視色譜圖中積分線合理而定，但在本次定量中，該值保持一致)。然后進(jìn)行計算，公式如下：

圖2 溴硝醇標(biāo)樣液相色譜圖

其中，

m1—稱取標(biāo)準(zhǔn)樣品的質(zhì)量, g；

m2—稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的總質(zhì)量, g；

m3—稱取待測樣品的質(zhì)量, g；

m4—稀釋后的待測樣品溶液的總質(zhì)量, g；

a—標(biāo)準(zhǔn)樣品中溴硝醇的含量, %;

x—待測樣品中溴硝醇的含量, %。

2 結(jié)果與討論

2.1 液相色譜實驗參數(shù)的調(diào)整選擇

通過查閱溴硝醇紫外吸收的光譜圖及相關(guān)文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)該物質(zhì)在215 nm波長下有較強(qiáng)吸收，所以我們選擇檢測器波長為215 nm。選擇流動相溶劑時，甲醇對帶有羥基官能團(tuán)的化合物有著更好的溶解性能。而從紫外吸收的角度來考慮，甲醇的截止波長為205 nm，但其在215 nm處的吸光度大于0.3 AU。對甲醇的吸收-波長曲線進(jìn)一步觀察可以得出如下結(jié)論，對于甲醇-水系統(tǒng)，若在波長215 nm進(jìn)行測定，應(yīng)控制溶劑的甲醇含量低于15%，這一點在后續(xù)梯度洗脫方法優(yōu)化時尤為重要，當(dāng)流動相梯度洗脫時進(jìn)行高靈敏度實驗，不論采用何種泵系統(tǒng)，因流動相成分產(chǎn)生的低吸收都將增大噪聲[3]。流動相中的磷酸可以很好地減少溴硝醇主峰的拖尾情況，修飾峰型。

2.2 方法的線性相關(guān)性驗證

運行一針1.4.1的標(biāo)樣樣品，時長30 min，利用變色龍工作站中的眼鏡蛇向?qū)占€噪聲，重新配制樣品至溴硝醇主峰濃度為基線噪聲3倍(S/N=3∶1)時[4]，選擇該濃度為溴硝醇在此系統(tǒng)下的最低檢出限，本次實驗得到其最低檢出限為1.15 mg/kg。在最低檢出限下下選擇1 mg/kg為起點選擇5 mg/kg、10 mg/kg、20 mg/kg、30 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg共6個點進(jìn)樣，將得到峰面積列為縱坐標(biāo)，濃度設(shè)為橫坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=16.914X+8.344 2，線性相關(guān)系數(shù)為0.999 8(見圖3)。

圖3 方法標(biāo)準(zhǔn)曲線

從同一溴硝醇-溶劑組合成品中分別取出5個樣品進(jìn)行測定完成精密度實驗，結(jié)果如表1所示。

表1 同一溴硝醇制劑樣品中5次溴硝醇含量測定結(jié)果

向空白基質(zhì)中分別添加一定量的溴硝醇標(biāo)樣粉末，在以上的測定方法與條件下進(jìn)行定量檢測，測得其回收率范圍為98.8%～100.4%，檢測結(jié)果如表2所示。

表2 溴硝醇制劑添加標(biāo)樣測得的回收率

2.3 方法應(yīng)用的普適性驗證

選取待測樣品A(卡松+溴硝醇)、待測樣品B(溴硝醇+OIT)對其中溴硝醇進(jìn)行定量分析，(如圖4、圖5所示)色譜圖中溴硝醇主峰峰型較好，并且與其它組分分離情況較好。其定量結(jié)果如表3所示。

表3 溴硝醇與其它物質(zhì)的復(fù)配制劑回收率測定結(jié)果

圖4 溴硝醇-卡松復(fù)配制劑色譜圖

圖5 溴硝醇-OIT復(fù)配制劑色譜圖

注意，當(dāng)溴硝醇與部分非水溶性物質(zhì)共存體系中時需要添加一定比例的乳化劑來降低混合體系中各組分的界面張力來形成均勻混合的乳狀液，在此類樣品的前處理階段時，甲醇流動相稀釋樣品和樣品超聲都會造成樣品破乳(可以明顯觀察到破乳現(xiàn)象)，所以在操作結(jié)束后需要對待測樣震蕩混勻并靜置，方可進(jìn)行余下操作。

3 結(jié)論

試驗結(jié)果表明，本方法檢測溴硝醇標(biāo)樣及其復(fù)配制劑中溴硝醇含量有較高的準(zhǔn)確度和精密度，線性關(guān)系良好，具有簡單、快速、準(zhǔn)確及分離效果好的優(yōu)點，是進(jìn)行產(chǎn)品質(zhì)量檢測較理想的分析方法。