芪斛楂顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升研究

安 巧 馮 敏 肖正會(huì) 萬(wàn) 科 柳小蘭 王海波 王道平*

1.省部共建藥用植物功效與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550014；2.貴州省中國(guó)科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550014；3.貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州 貴陽(yáng) 550025；4. 葵花藥業(yè)集團(tuán)(貴州)宏奇有限公司，貴州 六盤(pán)水 550000

芪斛楂顆粒是葵花藥業(yè)集團(tuán)(貴州)宏奇有限公司的獨(dú)家品種，由黃芪、炙甘草、茯苓、石斛、山楂、黨參、陳皮、白術(shù)等11味中藥組成。具有健脾和胃、益氣固表、消食導(dǎo)滯的功效，主要用于改善小兒脾胃氣虛、脾失健運(yùn)癥引起的厭食、偏食、汗多、大便不調(diào)、易感冒等癥狀。臨床研究發(fā)現(xiàn)，芪斛楂顆粒用于輔助治療小兒急性上呼吸道感染[1]、治療兒童營(yíng)養(yǎng)不良合并反復(fù)呼吸道感染[2]、治療小兒脾虛型腹瀉[3]、治療小兒厭食[4-5]、嬰兒腹瀉[6]，療效顯著。

芪斛楂顆粒各藥材來(lái)源產(chǎn)地較廣，質(zhì)量差異較大。復(fù)方中各處方原藥材需要從源頭進(jìn)行優(yōu)選和控制來(lái)保證芪斛楂顆粒優(yōu)質(zhì)有效，因此，在進(jìn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升研究前需對(duì)各原料藥品質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。目前，芪斛楂顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，只對(duì)甘草酸銨有含量測(cè)定要求，尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道其質(zhì)量控制的方法。處方中11味原料藥材所含化學(xué)成分組成復(fù)雜，個(gè)別成分的定性定量分析難以充分反映芪斛楂顆粒中所含化學(xué)成分的種類(lèi)與數(shù)量。指紋圖譜可較充分的反映出藥物所含各種化學(xué)成分量分布的整體狀況，可提高中藥復(fù)方質(zhì)量控制[7-9]，并為制劑藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究奠定基礎(chǔ)[10]。為更有效的控制制劑質(zhì)量，確保其臨床用藥的安全、有效，本實(shí)驗(yàn)首次采用高效液相色譜法(HPLC)建立芪斛楂顆粒的指紋圖譜，應(yīng)用對(duì)照品對(duì)其主要特征峰進(jìn)行指認(rèn)，對(duì)復(fù)方化學(xué)成分指紋圖譜色譜峰的歸屬進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器 Agilent 1100 高效液相色譜儀； KQ-300DA型數(shù)控超聲波清洗器；ME104E/02電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；EYELA-N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試藥 橙皮苷(批號(hào)110721-201316)、甘草苷(批號(hào)111610-201607)、甘草酸銨(批號(hào)110731-201720)、尿囊素(批號(hào)111501-200202)、齊墩果酸(批號(hào)110709-201808)、熊果酸(批號(hào)110742-201823)、白術(shù)內(nèi)酯I(批號(hào)111975-201501)、白術(shù)內(nèi)酯II(批號(hào)111976-201501)、白術(shù)內(nèi)酯III(批號(hào)111978-201501)、黨參炔苷(批號(hào)111732-201607)、黃芪甲苷(批號(hào)110781-201717)，以上標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均購(gòu)買(mǎi)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。茯苓酸(批號(hào)PCS-181120)、毛蕊異黃酮葡萄糖苷(批號(hào)PCS-190417)、石斛酚(批號(hào)PCS-190616)，購(gòu)自成都植標(biāo)化純。兒茶素(批號(hào)161209)由Chengdu Purechem-Standard Co.，Ltd.提供。

黃芪、山藥、炙甘草、茯苓、石斛、炒麥芽、山楂、木瓜、黨參、陳皮、白術(shù)，均由葵花藥業(yè)集團(tuán)(貴州)宏奇有限公司提供；芪斛楂顆粒(樣品批號(hào)：20190101、20190102、20190311、20190905、20190906、20190907、20190908、20190909、20190910、20190911)，均由葵花藥業(yè)集團(tuán)(貴州)宏奇有限公司生產(chǎn)；甲醇(色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，超純水(由純水/超純水-一體機(jī)制備)，乙腈(色譜純，默克股份兩合公司)，其他試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 11味處方原藥材有效含量參照文獻(xiàn)[11-17]進(jìn)行

1.2.2 色譜條件 色譜柱為CAPCELL PAK C18 4.6 mm×250 mm，5μm)；乙腈-水(A∶B)梯度洗脫：0～30 min，10%～40% A，30～50 min，40%～90%；50～60 min，90% A；流速1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

1.2.3 制備對(duì)照品 取甘草苷、橙皮苷對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，以色譜甲醇為溶劑，分別制成含甘草苷、橙皮苷約0.1 mg·mL-1溶液。

1.2.4 制備供試品 取芪斛楂顆粒約5.0 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱(chēng)定重量，超聲提取30 min，放冷，再稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量。搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液25 mL，濃縮至干，用甲醇定容至5 mL容量瓶中，搖勻后用微孔濾膜(0.45 μm)過(guò)濾，即得。

1.2.5 單味藥及陰性供試品溶液的制備 稱(chēng)取黃芪、葛根、陳皮及缺各單味藥材復(fù)方陰性藥材，按照各味藥的處方配比與處方工藝提取制備，并按照1.2.3項(xiàng)下方法制備。

2 結(jié)果

2.1 11味中藥材有效含量測(cè)定及品質(zhì)評(píng)價(jià) 11味處方原料藥材不同批次經(jīng)過(guò)檢測(cè)，結(jié)果如下：“陳皮20190603，陳皮20190601”中橙皮苷含量較高；“甘草JP-20180709，炙甘草20190101”中甘草苷、甘草酸含量較高；“茯苓JP-20180705，茯苓JP-20180706”中茯苓酸含量較高；“山藥JP-20190501，山藥JP-20190503”中尿囊素含量較高；“木瓜JP-20180803，木瓜飲片20190101”中齊墩果酸和熊果酸含量較高；“白術(shù)JP-20180801，白術(shù)(偏小)”中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的總量較高；“黨參20190601，黨參飲片20190101”中黨參炔苷的含量較高；“黃芪JP-20180704，黃芪JP-20180707”中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、黃芪甲苷含量較高；“山楂JP-20180701，山楂JP-20180803”中枸櫞酸含量較高；“麥芽20190502，麥芽20190503”中兒茶素含量較高；“流蘇石斛JP-20180701，流蘇石斛JP-20180702”中石斛酚含量較高。如圖1所示。

圖1 11味中藥材不同批次含量測(cè)定

由此可見(jiàn)，每味藥材不同批次樣品中有效成分的含量存在顯著差異。

2.2 指紋圖譜方法學(xué)考察

2.2.1 重復(fù)性試驗(yàn) 取芪斛楂顆粒(批號(hào)：20190311)，按1.2.4項(xiàng)下方法，平行制備供試品溶液5份，按1.2.2項(xiàng)下色譜條件，記錄色譜圖。以橙皮苷的色譜峰為參照峰(S)，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積。結(jié)果表明，16個(gè)共有峰，相對(duì)保留時(shí)間RSD均低于0.4 %，相對(duì)峰面積RSD均低于5.0 %。

2.2.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取芪斛楂顆粒(批號(hào)：20190311)，按1.2.4項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按1.2.2項(xiàng)下色譜條件，分別在0 h、2.5 h、5 h、10 h、15 h、20 h、25 h、30 h、48 h進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以橙皮苷的色譜峰為參照峰(S)，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積。結(jié)果表明，16個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于0.5 %，相對(duì)峰面積RSD均低于5.0 %，供試品溶液在48 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.3 精密度試驗(yàn) 取芪斛楂顆粒(批號(hào)：20190311)，按1.2.4項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按1.2.2項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。以橙皮苷的色譜峰為參照峰(S)，計(jì)算16個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積。結(jié)果表明，16個(gè)共有峰，相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于0.6 %，相對(duì)峰面積RSD均低于3.0 %。

2.3 芪斛楂顆粒液相指紋圖譜建立及特征峰標(biāo)定

2.3.1 芪斛楂顆粒HPLC指紋圖譜的建立及評(píng)價(jià) 取10批芪斛楂顆粒樣品，按1.2.4項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按1.2.2項(xiàng)下色譜條件，依次進(jìn)樣測(cè)定，記錄樣品色譜圖。

將10批芪斛楂顆粒的HPLC圖譜以AIA格式導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”(2012版)軟件，采用S1號(hào)樣品(批號(hào)20190311)的指紋圖譜作為參照?qǐng)D譜，時(shí)間窗寬度為0.50，中位數(shù)法，經(jīng)多點(diǎn)校正自動(dòng)匹配后生成芪斛楂顆粒共有模式對(duì)照指紋圖譜；確認(rèn)了16個(gè)共有峰。10批芪斛楂顆粒HPLC指紋圖譜疊加圖及對(duì)照指紋圖譜如圖2所示。

A．10批樣品疊加圖譜； B．共有模式對(duì)照?qǐng)D譜圖2 芪斛楂顆粒HPLC指紋圖譜

以共有模式對(duì)照指紋圖譜作為參照?qǐng)D進(jìn)行了相似度計(jì)算，10批芪斛楂顆粒樣品與共有模式對(duì)照指紋圖譜的相似度在0.985 ～ 0.999，各批樣品的相似度較好。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 10批供試品與對(duì)照指紋圖譜的相似度

2.3.2 芪斛楂顆粒復(fù)方與藥材指紋圖譜色譜峰相關(guān)性分析 按1.2.4項(xiàng)下方法制備芪斛楂供試品溶液、藥材對(duì)照溶液、芪斛楂顆粒陰性對(duì)照溶液，按1.2.2項(xiàng)下色譜條件，記錄色譜圖。利用色譜峰保留時(shí)間考察相關(guān)性，對(duì)芪斛楂顆粒HPLC指紋圖譜的16個(gè)峰歸屬進(jìn)行分析。

16個(gè)共有峰歸屬到各藥材，其中14號(hào)峰來(lái)源于白術(shù)；2號(hào)、6號(hào)、14號(hào)峰來(lái)源于陳皮；4號(hào)、5號(hào)、7號(hào)、15號(hào)、16號(hào)峰來(lái)源于甘草；11號(hào)峰來(lái)源于黃芪；12號(hào)、13號(hào)峰來(lái)源于流蘇石斛。

2.3.3 采用對(duì)照品法對(duì)芪斛楂顆粒指紋圖譜各個(gè)色譜峰的指認(rèn) 根據(jù)芪斛楂顆粒HPLC指紋圖譜共有峰和各味藥材色譜峰的歸屬分析，有針對(duì)性的配制了甘草苷、橙皮苷對(duì)照品溶液，分別精密吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。通過(guò)與對(duì)照品對(duì)比共指認(rèn)了2個(gè)色譜峰，確認(rèn)5號(hào)峰為甘草苷(如圖3所示)，6號(hào)峰為橙皮苷(如圖4所示)。

圖3 芪斛楂顆粒、甘草及甘草苷的圖譜

圖4 芪斛楂顆粒、陳皮及橙皮苷的圖譜

在共有峰中，6號(hào)峰是芪斛楂顆粒中的主要活性成分之一，理化性質(zhì)穩(wěn)定，基線(xiàn)分離度好，故選為參照峰。

3 討論

3.1 提取溶劑的考察 本實(shí)驗(yàn)對(duì)提取溶劑進(jìn)行篩選，分別用70 %乙醇、95 %乙醇、70 %甲醇、甲醇提取樣品，結(jié)果采用70 %甲醇、甲醇提取所得的色譜峰均較好，為簡(jiǎn)便實(shí)驗(yàn)操作及方便溶劑回收利用，選擇甲醇作為提取溶劑。

3.2 提取方法的選擇 本實(shí)驗(yàn)對(duì)提取方法進(jìn)行考察，分別采用超聲提取和回流提取樣品，結(jié)果表明，超聲提取和回流提取的結(jié)果無(wú)顯著差異，為實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)便，選擇超聲提??；本實(shí)驗(yàn)對(duì)樣品進(jìn)行超聲30 min、超聲60 min提取，結(jié)果表明，使用甲醇超聲30 min和甲醇超聲60 min所得色譜峰一致，為了節(jié)約時(shí)間，選擇甲醇超聲30 min作為提取條件。

3.3 流動(dòng)相的選擇 由于本樣品中成分復(fù)雜，故采用梯度洗脫的方式，先后嘗試甲醇-水、乙腈-水流動(dòng)相系統(tǒng)，并且嘗試了多種不確定的梯度條件，經(jīng)過(guò)對(duì)各種色譜圖的比較，最后確定乙腈-水為流動(dòng)相，采用梯度洗脫，分離度理想，特征峰明顯。

3.4 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 取供試品溶液進(jìn)樣，采用二極管陣列檢測(cè)器進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，并對(duì)各波長(zhǎng)下的色譜圖進(jìn)行分析比較，芪斛楂顆粒大部分成分在230 nm有較大吸收，因此選擇230 nm作為指紋圖譜檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.5 共有峰的歸屬 比較復(fù)方與處方原料藥材的色譜圖發(fā)現(xiàn)，處方藥材對(duì)共有峰的貢獻(xiàn)為白術(shù)(14號(hào)峰)、陳皮(2號(hào)、6號(hào)、14號(hào)峰)、甘草(4號(hào)、5號(hào)、7號(hào)、15號(hào)、16號(hào)峰)、黃芪(11號(hào)峰)、流蘇石斛(12號(hào)、13號(hào)峰)。所歸屬的色譜峰都能與藥材和復(fù)方對(duì)應(yīng)，有良好的相關(guān)性。14號(hào)峰的貢獻(xiàn)來(lái)源于白術(shù)和陳皮。雖然有與茯苓對(duì)照藥材相對(duì)應(yīng)的色譜峰(16號(hào)峰)，但在茯苓陰性樣品的指紋圖譜中也有該色譜峰，說(shuō)明16號(hào)峰不是茯苓專(zhuān)屬，僅與茯苓有關(guān)；雖然有與山楂對(duì)照藥材相對(duì)應(yīng)的色譜峰(1號(hào)、2號(hào)峰)，但在山楂陰性樣品的指紋圖譜中也有該色譜峰，說(shuō)明這兩個(gè)色譜峰不是山楂專(zhuān)屬，僅與山楂有關(guān)；未見(jiàn)與黨參、麥芽、木瓜、山藥有關(guān)的色譜峰，可能由于復(fù)方在煎煮過(guò)程中，成分之間相互發(fā)生作用導(dǎo)致成分轉(zhuǎn)化或損失；其中3號(hào)、8號(hào)、9號(hào)、10號(hào)峰不能得到歸屬，可能是在制劑制備過(guò)程中11味藥材共煎而產(chǎn)生的。綜上所述，復(fù)方與處方藥材的成分存在差異，兩者之間并非簡(jiǎn)單的加和關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)對(duì)復(fù)方成分的來(lái)源歸屬作了初步研究，為闡明芪斛楂顆粒的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供了依據(jù)。

本研究通過(guò)精密度試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)和重復(fù)性試驗(yàn)對(duì)芪斛楂顆粒HPLC指紋圖譜方法進(jìn)行了方法學(xué)考察，建立了芪斛楂顆粒HPLC指紋圖譜，共標(biāo)定16個(gè)共有峰，指認(rèn)了其中2個(gè)色譜峰。采用所建立的方法對(duì)10批芪斛楂顆粒樣品進(jìn)行了指紋圖譜測(cè)定，采用相似度分析方法對(duì)樣品進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，本研究建立的芪斛楂顆粒HPLC指紋圖譜方法穩(wěn)定、可靠、重現(xiàn)性好，可為葵花藥業(yè)芪斛楂顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升提供依據(jù)。