基于ITS2序列的鉤藤屬藥用植物的分子鑒定

王江瑞，談利紅，熊可慧，姜理華*，唐倩（. 江蘇知原藥業(yè)股份有限公司，江蘇 無錫 494；. 重慶醫(yī)藥高等?？茖W校，重慶 40；. 國家衛(wèi)生健康委能力建設和繼續(xù)教育中心，北京 00044）

中藥材鉤藤為茜草科鉤藤屬的多基源植物，《中國藥典》2020年版中將鉤藤（Uncaria rhynchophylla（Miq.）Miq. ex Havil）、華鉤藤（Uncaria sin-ensis（Oliv）. Havil.）、大葉鉤藤（Uncaria macrophyllaWall.）、毛鉤藤（Uncaria hirsuteHavil.）以及無柄果鉤藤（Uncaria sessilifructusRoxb.）收錄于鉤藤項下，其藥用部位均為干燥帶鉤的莖枝[1]。除此之外，市場上的商品鉤藤種類十分混亂，除藥典規(guī)定的外還摻有攀莖鉤藤[Uncariascandens（Smith）Hutchins.]等其他鉤藤屬植物。對于中藥材的鑒定，一般采用性狀鑒定、顯微鑒定以及理化鑒定等傳統(tǒng)手段[2]，由于鉤藤屬植物其化學性質(zhì)、外觀性狀都差異不大，因此很難運用傳統(tǒng)手段將其區(qū)分。近年來，分子生物學技術不斷發(fā)展，并在中藥材鑒別領域得到了廣泛的運用[3-9]，本文采用DNA條形碼技術對藥典中鉤藤屬植物及其混偽品進行測序并構建其發(fā)育樹，并與GenBank中現(xiàn)有鉤藤屬植物的ITS2序列進行對比歸類，從而從分子遺傳學上對其進行鑒別，為鉤藤屬植物的鑒別提供依據(jù)。

1 材料

Allegra X-30R Centrifuge離心機（BECKMAN COULTER公司）；凝膠電泳成像系統(tǒng)、iCycleriQ Multi-Color Real-Time PCR儀（BIO-RAD公 司）；全自動進樣品快速球磨儀（上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司）；dNTP，2×Taq PCR MasterMix（天根生化科技有限公司）；植物DNA提取試劑盒（ThermoFisher）；通用引物ITS2F/ITS3R由成都擎科梓熙生物技術有限公司合成。

本研究所用的鉤藤來自云南、四川、廣州等地，包括6個物種31個樣品，具體信息見表1。實驗室樣品經(jīng)重慶醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院王剛教授鑒定為茜草科Rubiaceae植物鉤藤的干燥帶鉤莖枝。

表1 藥材及其來源Tab 1 Medicinal materials and their source

2 方法與結(jié)果

2.1 DNA提取

取鉤藤新鮮葉片各約30 mg，加入2 mL液氮，用DNA快速球磨儀研磨5 min（30次·s－1），用植物DNA提取試劑盒提取總DNA，沉淀劑為三氯甲烷[10]，其余步驟均按照試劑盒說明書進行。

2.2 PCR擴增及測序 PCR擴增正向引物ITS2F為5'＞ATGCGATACTTGGTGTGAAT＜3'，反向引物ITS3R為5'＞GACGCTTCTCCAGACTACAAT＜3'。PCR反應體系為25 μL，包括2×Easy Taq PCR Super Mix（Trans Gen Biotech Co.）12.5 μL，2.5 μmol·L－1正反引物各1.0 μL，模板DNA為2 μL，ddH2O為8.5 μL。PCR擴增程序：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，退火溫度為56℃，30 s；72℃延伸2 min，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。反應結(jié)束后取5 μL反應產(chǎn)物，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測純度，觀察到條帶單一，表明PCR擴增良好（見圖1），再將擴增好的DNA送至華大基因科技有限公司進行雙向測序。從PCR擴增圖可以看出，鉤藤屬植物的ITS序列長度約在500～750 bp，并且不同種之間序列長度差異較小。

圖1 樣品PCR擴增結(jié)果Fig 1 PCR amplification results of samples

2.3 序列數(shù)據(jù)處理與提交

利用CodonCode Aligner V 6.0.2對測序峰圖進行校對拼接，除去引物區(qū)?；陔[馬爾夫模型的HMMer注釋方法將所有測得的序列用CodonCode Aligner V 6.0.2除去兩端的5.8 S和28 S區(qū)，從而獲得內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS2序列。再利用MEGA6.0進行序列的分析比對，并計算K2P遺傳距離，建立NJTree。

2.4 聚類分析

通過MEGA 6.0軟件，基于各個鉤藤的ITS2序列，構建NJTree（見圖2，支上數(shù)值僅顯示自展支持率≥50%），從圖中可以看出，鉤藤屬6個種17個樣本各聚為一類，并依次與GenBank中鉤藤屬的各個種相聚為一類，表現(xiàn)出單系性，與其他同屬植物之間可以明顯地區(qū)分。再者，華鉤藤與鉤藤親緣關系較藥典收載的其他鉤藤更近，這與朱爽等[11]分析的結(jié)果一致。因此，ITS2序列作為DNA條形碼可準確快速地鑒別鉤藤屬及其近緣物種。

圖2 基于ITS2序列構建的鉤藤屬NJTree（boot strap score 1000 replicates）Fig 2 NJTree of Uncaria Schreber nom. cons. based on ITS2 squence

2.5 鉤藤屬ITS2序列特征

本研究比較了鉤藤屬6個種17個樣品，其ITS2序列長度在220～224 bp，大葉鉤藤、毛鉤藤、華鉤藤、無柄果鉤藤以及攀莖鉤藤相對于鉤藤在ITS2序列上各出現(xiàn)11、4、3、13和8個變異位點；與下載于GenBank上的鉤藤屬標準藥材進行比對，并應用MEGA 6.0軟件以Kimura 2-parameter（K2P）計算遺傳距離，其鉤藤屬種內(nèi)遺傳距離為0～0.020，構建其NJTree可以明顯區(qū)分鉤藤與攀莖鉤藤。

3 結(jié)論與討論

鉤藤是我國傳統(tǒng)中常用的息風止痙類中藥，其茜草科鉤藤屬植物在全世界約有70多種，我國約有14多種，其物產(chǎn)資源豐富[12]，而《中國藥典》中只收載了5種鉤藤屬植物，市場上銷售的鉤藤藥材較為混亂，僅靠傳統(tǒng)手段難以區(qū)分，為了正本清源以及有效快速準確鑒定鉤藤屬植物，本研究運用了DNA條形碼技術來對其進行鑒別。結(jié)果表明運用ITS2序列能明顯區(qū)別藥典中收載的5種鉤藤植物及攀莖鉤藤，同時根據(jù)構建的系統(tǒng)聚類樹也能很清楚地將其區(qū)分。DNA條形碼技術是近年來國際上發(fā)展起的新的生物物種鑒定技術，應用DNA分子標記技術對中藥材原植物進行鑒定已成為研究的熱點[13-18]，DNA條形碼技術因其不受外界因素、生物發(fā)育階段或器官組織的影響，為基因水平的鑒定提供了一定的基礎，并且中藥材的DNA分子標記技術都是以ITS2序列為主，以psbA-trnH為補充序列來對其進行鑒定。

本研究分別從不同地區(qū)收集6種鉤藤屬樣品，并進行基因組DNA提取，ITS2 區(qū)序列擴增，序列測定與分析，以及采用MP構建該鉤藤樣品在其近緣種之間的NJTree樹，從圖中可以看出樣品華鉤藤與GenBank數(shù)據(jù)庫中已有的華鉤藤（KX675015）聚為一支，支持率達到95%，然后又與鉤藤聚為一支；樣品大葉鉤藤、無柄果鉤藤以及毛鉤藤單獨聚為一支，支持率分別達到96%、99%及87%。由此可見，從分子生物學和遺傳學的角度分析，各個鉤藤屬樣品與GenBank數(shù)據(jù)庫中相應鉤藤相對應，并聚為同一支，并且可以很好地區(qū)分各個鉤藤屬相近的物種。

因此，采用DNA分子技術——ITS2序列能更加準確、高效、快速地用于植物物種之間的鑒別，為鉤藤藥材以及其他藥用植物的真?zhèn)舞b別提供有效的手段，同時為藥品監(jiān)管部門提供可靠手段。