2-三氟甲基-3-硝基-喹啉-4-胺衍生物的合成及其抗腫瘤活性研究

張偲偲，余佳，曾曉萍，梁光義，孟雪玲，徐必學(xué)*（1. 貴州醫(yī)科大學(xué) 省部共建藥用植物功效與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽 550014；2. 貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴陽 550025；3. 貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽 550014）

喹啉及其衍生物是一類非常重要的氮雜環(huán)化合物[1]，具有多方面的生物活性，如抗瘧疾[2-3]、抗菌[4-6]、抗炎癥[7]、抗驚厥、降壓、抗糖尿病、抗腫瘤[8-9]等，在制藥工業(yè)中應(yīng)用廣泛。馬來酸來那替尼和馬來酸吡咯替尼都是喹啉類酪氨酸激酶抑制劑，它們均是通過阻止表皮生長因子受體的信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，來達(dá)到抗腫瘤的目的[10]。有研究表明喹啉作為抗腫瘤藥物時，其母核3位氰基可以與水分子結(jié)合，該水分子可以充當(dāng)藥物和酶之間連接的橋梁從而發(fā)揮藥效，Li等[11]采用硝基替代氰基，也獲得具有良好抗腫瘤活性的化合物，且硝基在抗腫瘤藥物中應(yīng)用廣泛[12]。醛氧化酶（aldehyde oxidase，AOX）是存在于哺乳動物細(xì)胞質(zhì)中的一類含鉬-黃素蛋白，具有廣泛的底物特異性，可催化醛類及含氧、含氮雜環(huán)類化合物的氧化反應(yīng)[13-16]。由于AOX的氧化作用，在體內(nèi)代謝過程中，2-位無取代喹啉類藥物易被氧化成2-喹啉酮類化合物，此類化合物易結(jié)晶沉淀而引起腎臟毒性[17-18]。

由于氟原子具有最強(qiáng)的電負(fù)性（4.0）和很強(qiáng)的C-F鍵等特殊性，使得含氟化合物在許多領(lǐng)域，特別是在醫(yī)藥領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[19]，通過引入三氟甲基（-CF3）取代基能顯著改變原化合物的化學(xué)穩(wěn)定性、親脂親油性、生物膜通透性、體內(nèi)代謝穩(wěn)定性及其與生物蛋白酶結(jié)合的能力等[20]。如為改善奎寧2-位易被氧化失活的問題，研究人員在2-位引入CF3，從而發(fā)現(xiàn)了代謝阻滯劑甲氟喹，其不良反應(yīng)大大減小，活性更強(qiáng)（見圖1）。

圖1 來那替尼、吡咯替尼、奎寧、甲氟喹和擬合成的目標(biāo)化合物結(jié)構(gòu)式Fig 1 Structural formula of neratinib，pyrotinib，quinine，mefloquine and target compounds

結(jié)合三氟甲基取代的優(yōu)點(diǎn)和喹啉母核作為抗腫瘤藥物這一優(yōu)勢結(jié)構(gòu)，本文設(shè)計合成了一系列2-三氟甲基-3-硝基-喹啉-4-胺衍生物（見圖2），并以阿霉素為陽性對照，采用MTT法[21]測試目標(biāo)化合物對乳腺癌細(xì)胞（MDA-231）、前列腺癌細(xì)胞（LNCAP）、人肺癌細(xì)胞（A549）、前列腺癌細(xì)胞（PC3）的體外抑制活性。

1 儀器與試藥

GB3002型電子天平（METTLER TOLEDO）；MYP19-2型磁力攪拌器（上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司）；Rotavaper R-114型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（BUCHI）；XT-4型熔點(diǎn)儀（上海華巖儀器設(shè)備有限公司）；Bruker Avance NEO 600 MHz型 核磁共振儀（DMSO-d6或CDCl3為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo)，瑞士Bruker公司）；HP-5793型質(zhì)譜儀（Hewlett-Packard公司）；恒溫培養(yǎng)箱（美國Grant公司）；超低溫冰箱（美國Beckman公司）；顯微鏡（Olympus Corporation）；多功能酶標(biāo)儀（美國Biotek公司）。柱層析硅膠（200～300目）和薄層層析硅膠板（青島海洋化工廠）；四氮唑藍(lán)（MTT，Sigma公司）；所用試劑均為市售分析純或化學(xué)純；A549細(xì)胞（湖南豐暉生物科技有限公司）；PC3細(xì)胞、LNcap細(xì)胞、MDA-231細(xì)胞（貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）。

2 方法與結(jié)果

2.1 目標(biāo)化合物合成路線

將4-甲氧基苯胺和三氟乙酰乙酸乙酯以多聚磷酸催化反應(yīng)得化合物1，1經(jīng)硝化反應(yīng)得化合物2，2進(jìn)行氯代反應(yīng)得化合物3，3與苯胺類化合物進(jìn)行偶聯(lián)得喹啉類衍生物4a～4f，4a～4d經(jīng)N-烷基化反應(yīng)得化合物5a～5d'（見圖2）。

圖2 目標(biāo)化合物的合成路線圖Fig 2 Synthesis route of target compounds

2.2 化學(xué)合成

2.2.1 2-三氟甲基-4-羥基-6-甲氧基-喹啉（化合物1）的合成 取多聚磷酸22.00 g（65.10 mmol）、4-甲氧基苯胺2.00 g（16.20 mmol）于250 mL反應(yīng)瓶內(nèi)，置換氬氣，于100℃下攪拌0.5 h后緩慢注入三氟乙酰乙酸乙酯2.40 mL（16.40 mmol），注入完畢升溫至110℃。反應(yīng)4 h至完畢，將反應(yīng)物分散至冰水混合物中并且迅速攪拌，大量固體析出，抽濾，濾餅水洗至中性，減壓烘干即得化合物1，收率：77.9%。1H NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ7.91（d，J＝8.4 Hz，1H），7.52～7.35（m，2H），7.10（s，1H），3.89（s，3H）；13C NMR（151 MHz，DMSO-d6）δ162.1，158.4，145.4，144.4，131.1，123.3，122.7，125.1～119.1（m），100.5，100.3，56.0；19F NMR（565 MHz，DMSO-d6）δ－66.12。

2.2.2 2-三氟甲基-3-硝基-6-甲氧基-4-氯-喹啉（化合物3）的合成 取化合物1 2.00 g（8.22 mmol）于反應(yīng)瓶內(nèi)，加入冰醋酸50 mL，置換氬氣，40℃下緩慢滴加濃硝酸0.70 mL（9.86 mmol）。40℃下攪拌11 h至反應(yīng)完全，反應(yīng)體系內(nèi)析出大量沉淀，抽濾，水洗濾餅至中性，減壓烘干即得化合物2共1.61 g，取化合物2的粗品1.61 g，加入20 mL DMF將其完全溶解，置換氬氣，于100℃下，緩慢注入三氯氧磷1.53 mL（16.76 mmol）。攪拌2 h后反應(yīng)完畢，將反應(yīng)體系分散于乙酸乙酯和水中，萃取，有機(jī)層用水洗滌兩次，無水硫酸鎂干燥，減壓回收溶劑，殘余物經(jīng)硅膠柱層析純化，得化合物3（共1.21 g），收率：75.2%。1H NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ8.23（d，J＝9.2 Hz，1H），7.78（dd，J＝9.2，2.6 Hz，1H），7.54（s，1H），4.05（s，3H）；13C NMR（151 MHz，DMSO-d6）δ162.4，142.1，140.7，133.2（q，J＝34.2 Hz），133.9，132.7，128.4，127.6，120.4（q，J＝275.6 Hz），103.3，56.9；19F NMR（565 MHz，DMSO-d6）δ－63.62。

2.2.3 化合物4的合成（以4a為例） 取化合物3 200 mg（652 μmol），注入冰醋酸3 mL，置換氬氣，加入4-氟苯胺310 μL（326 μmol），100℃下攪拌24 h至反應(yīng)完全，將反應(yīng)物分散于乙酸乙酯和水中，萃取，有機(jī)層用水洗滌兩次，無水硫酸鎂干燥，減壓回收溶劑，殘余物經(jīng)硅膠柱層析純化，得黃色固體狀化合物4a，收率為73.5%。參照上述方法合成4b～4f。

2-三氟甲基-N-（4-氟苯基）-3-硝基-6-甲氧基-喹啉-4-胺（4a）：黃色固體，m.p.129～132℃，1H NMR（600 MHz，CDCl3）δ8.04（d，J＝9.2 Hz，1H），7.97（s，1H），7.41（dd，J＝9.2，2.6 Hz，1H），7.10～6.95（m，4H），6.87（d，J＝2.6 Hz，1H），3.50（s，3H）；13C NMR（151 MHz，CDCl3）δ160.8，159.1，159.0，142.8，141.4，137.9（q，J＝35.8 Hz），137.3（d，J＝3.0 Hz），133.2，132.7，125.2，123.7（d，J＝7.8 Hz），122.3，120.4（q，J＝275.5 Hz），116.6，116.4，104.5，55.3；19F NMR（565 MHz，CDCl3）δ－63.81，－116.21；MS（ESI）m/z：382.0 [M＋H]＋。

2-三氟甲基-N-（3，4-二氯苯基）-3-硝基-6-甲氧基-喹啉-4-胺（4b）：收率為65.0%。黃色固體，m.p. 188～193℃，1H NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ9.70（s，1H），8.10（d，J＝9.2 Hz，1H），7.72（d，J＝2.5 Hz，1H），7.65（dd，J＝9.2，2.6 Hz，1H），7.55（d，J＝8.7 Hz，1H），7.36（d，J＝2.6 Hz，1H），7.07（dd，J＝8.7，2.6 Hz，1H），3.92（s，3H）；13C NMR（151 MHz，DMSO-d6）δ160.3，149.6，141.9，140.8，136.4（q，J＝34.8 Hz），132.4，131.8，131.2，126.2，125.4，122.6，121.32（q，J＝275.5 Hz），121.2，114.9，114.5，103.4，56.6；19F NMR（565 MHz，DMSO-d6）δ－63.1；MS（ESI）m/z：432.1 [M＋H]＋。

2-三氟甲基-N-（苯基）-3-硝基-6-甲氧基-喹啉-4-胺（4c）：收率為78.0%。黃色固體，m.p.135～142℃，1H NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ9.61（s，1H），8.03（d，J＝9.2 Hz，1H），7.81（d，J＝2.6 Hz，1H），7.59（dd，J＝9.2，2.7 Hz，1H），7.32（dd，J＝8.2，7.6 Hz，2H），7.16（t，J＝7.4 Hz，1H），7.10（d，J＝7.6 Hz，2H），3.88（s，3H）；13C NMR（151 MHz，DMSO-d6）δ159.9，141.6，141.5，139.9，136.6（q，J＝33.9 Hz），132.3，130.2，129.4，125.4，125.0，124.4，122.3，121.37（q，J＝276.0 Hz），103.4，56.5；19F NMR（565 MHz，DMSO-d6）δ－63.17；MS（ESI）m/z：364.1 [M＋Na]＋。

2-三氟甲基-N-（4-三氟甲氧基苯基）-3-硝基-6-甲氧基-喹啉-4-胺（4d）：收率為75.5%。黃色固體，m.p. 115～131℃，1H NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ9.69（s，1H），8.07（d，J＝9.2 Hz，1H），7.74（d，J＝2.6 Hz，1H），7.62（dd，J＝9.2，2.6 Hz，1H），7.31（d，J＝8.4 Hz，2H），7.21（dd，J＝9.5，2.6 Hz，2H），3.88（s，3H）；13C NMR（151 MHz，DMSO-d6）δ160.1，145.1，141.7，141.4，139.6，136.5（q，J＝34.6 Hz），132.4，131.1，125.3，124.6，123.4，122.2，121.57（q，J＝275.7 Hz），120.62（q，J＝275.6 Hz），103.5，56.5；19F NMR（565 MHz，DMSO-d6）δ－57.16，－63.20；MS（ESI）m/z：448.0 [M＋H]＋。

2-三氟甲基-N-（4-氯苯基）-3-硝基-6-甲氧基-喹啉-4-胺（4e）：收率為70.0%。黃色固體，m.p. 180～183℃，1H NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ9.67（s，1H），8.07（d，J＝9.2 Hz，1H），7.79（d，J＝2.6 Hz，1H），7.62（dd，J＝9.2，2.6 Hz，1H），7.44～7.30（m，2H），7.12（d，J＝8.7 Hz，2H），3.91（s，3H）；13C NMR（151 MHz，DMSO-d6）δ160.1，141.6，141.3，139.2，136.5（q，J＝34.5 Hz），132.4，130.7，129.3，128.9，125.2，124.6，121.59（q，J＝275.8 Hz），103.4，56.6；19F NMR（565 MHz，DMSO-d6）δ－63.15；MS（ESI）m/z：400.1 [M＋Na]＋。

2-三氟甲基-N-（2，3，4-三氟苯基）-3-硝基-6-甲氧基-喹啉-4-胺（4f）：收率為60.0%。黃色固體，m.p. 210～214℃，1H NMR（600 MHz，CDCl3）δ8.14（d，J＝9.3 Hz，1H），7.53（dd，J＝9.2，2.7 Hz，1H），7.46（s，1H），6.89（d，J＝2.7 Hz，1H），6.53（dd，J＝8.1，5.7 Hz，2H），3.68（s，3H）；13C NMR（151 MHz，CDCl3）δ160.0，152.49（q，J＝103.52 Hz），143.1，138.9，137.6，137.46（q，J＝35.8 Hz），135.5，133.0，125.7，123.3，120.24（q，J＝275.5 Hz），104.5（d，J＝5.7 Hz），104.4（d，J＝5.4 Hz），103.7，55.7；19F NMR（565 MHz，CDCl3）δ－63.90，－131.38，－131.42，－164.96；MS（ESI）m/z：440.1 [M＋Na]＋。

2.2.4 化合物5的合成（以5a為例） 取化合物4a 300 mg（0.79 mmol）、NaH 39.2 mg（0.98 mmol）于反應(yīng)瓶中，置換氬氣，加入4 mL DMF，攪拌下注入碘甲烷98.0 μL（1.57 mmol），室溫反應(yīng)48 h至反應(yīng)完全，將反應(yīng)物分散于乙酸乙酯和水中，萃取，有機(jī)層用水洗滌兩次，無水硫酸鎂干燥，減壓回收溶劑，殘余物經(jīng)硅膠柱層析純化，得化合物5a 150 mg，收率為48.4%。參照上述方法合成5b～5d'。

2-三氟甲基-N-甲基-N-（4-氟苯基）-3-硝基-6-甲氧基-喹啉-4-胺（5a）：黃色固體，m.p.117～146℃，1H NMR（600 MHz，CDCl3）δ8.19（d，J＝9.3 Hz，1H），7.53（dd，J＝9.3，2.8 Hz，1H），6.98（d，J＝2.7 Hz，1H），6.97～6.91（m，2H），6.69～6.63（m，2H），3.76（s，3H），3.39（s，3H）；13C NMR（151 MHz，CDCl3）δ161.1，157.5，144.9，144.2，143.2，141.8，136.8（q，J＝36.9 Hz），132.8，129.1，125.7，120.3（q，J＝275.9 Hz），116.4（d，J＝8.1 Hz），116.1（d，J＝22.5 Hz），102.1，55.8，39.7；19F NMR（565 MHz，CDCl3）δ－64.39；MS（ESI）m/z：418.1 [M＋Na]＋。

2-三氟甲基-N-甲基-N-（3，4-二氯苯基）-3-硝基-6-甲氧基-喹啉-4-胺（5b）：收率為80.0%。黃色固體，m.p. 120～134℃，1H NMR（600 MHz，CDCl3）δ8.23（d，J＝9.3 Hz，1H），7.58（dd，J＝9.3，2.7 Hz，1H），7.22（d，J＝8.9 Hz，1H），6.91（d，J＝2.7 Hz，1H），6.78（s，1H），6.39（d，J＝7.4 Hz，1H），3.81（s，3H），3.36（s，3H）；13C NMR（151 MHz，CDCl3）δ161.6，146.0，144.4，143.2，142.0，136.6（q，J＝36.7 Hz），133.4，133.0，130.9，128.9，126.1，123.6，120.1（q，J＝275.7 Hz），115.4，113.9，101.6，55.9，39.4；19F NMR（565 MHz，CDCl3）δ－64.39；MS（ESI）m/z：446.1 [M＋H]＋。

2-三氟甲基-N-甲基-N-苯基-3-硝基-6-甲氧基-喹啉-4-胺（5c）：收率為77.8%。黃色固體，m.p. 126～142℃，1H NMR（600 MHz，CDCl3）δ8.19（d，J＝9.3 Hz，1H），7.52（dd，J＝9.3，2.8 Hz，1H），7.23（dd，J＝8.5，7.5 Hz，2H），6.98（d，J＝2.7 Hz，1H），6.92（t，J＝7.4 Hz，1H），6.70（d，J＝8.0 Hz，2H），3.72（s，3H），3.41（s，3H）；13C NMR（151 MHz，CDCl3）δ161.0，146.8，145.0，144.3，142.0，136.6（d，J＝33.9 Hz），132.7，129.5，129.3，125.8，120.7，121.37（d，J＝276.0 Hz），115.0，102.2，55.8，39.3；19F NMR（565 MHz，CDCl3）δ－64.41；MS（ESI）m/z：400.1 [M＋Na]＋。

2-三氟甲基-N-甲基-N-（4-三氟甲氧基苯基）-3-硝基-6-甲氧基-喹啉-4-胺（5d）：收率為39.8%。黃色固體，m.p. 96～110℃，1H NMR（600 MHz，CDCl3）δ8.22（d，J＝9.3 Hz，1H），7.56（dd，J＝9.3，2.8 Hz，1H），7.10（d，J＝8.8 Hz，2H），6.95（d，J＝2.7 Hz，1H），6.67～6.58（m，2H），3.75（d，J＝8.2 Hz，3H），3.71～3.65（m，2H），1.77（dt，J＝18.8，7.6 Hz，2H），0.97（t，J＝7.4 Hz，3H）；13C NMR（151 MHz，CDCl3）δ161.1，145.0，144.3，143.7，142.5，142.3，136.7（q，J＝36.9 Hz），132.8，129.6，125.8，122.5，120.92（q，J＝255.5 Hz），120.29（q，J＝276.5 Hz），115.8，102.3，55.7，39.5；19F NMR（565 MHz，CDCl3）δ－58.35，－64.45；MS（ESI）m/z：462.1 [M＋H]＋。

2-三氟甲基-N-丙基-N-（4-三氟甲氧基苯基）-3-硝基-6-甲氧基-喹啉-4-胺（5d'）：收率為41.1%。黃色固體，m.p. 107～132℃，1H NMR（600 MHz，CDCl3）δ8.23（d，J＝9.3 Hz，1H），7.58（dd，J＝9.3，2.7 Hz，1H），7.22（d，J＝8.9 Hz，1H），6.91（d，J＝2.7 Hz，1H），6.78（s，1H），6.39（d，J＝7.4 Hz，1H），3.81（s，3H），3.36（s，3H）；13C NMR（151 MHz，CDCl3）δ161.6，146.0，144.4，143.2，142.0，136.6（q，J＝36.7 Hz），133.0，130.9，128.9，126.1，123.6，120.7（q，J＝256.7 Hz），120.1（q，J＝275.7 Hz），115.4，113.9，101.6，56.0，21.2，11.1；19F NMR（565 MHz，CDCl3）δ－58.35，－64.45；MS（ESI）m/z：490.1 [M＋H]＋。

2.3 抗腫瘤活性測試

以阿霉素為陽性對照，采用MTT法測試目標(biāo)化合物對MDA-231、LNCAP、A549、PC3細(xì)胞的體外抑制活性。分別取上述4種處于對數(shù)期的癌細(xì)胞，接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h，取目標(biāo)化合物及阿霉素用DMSO溶解完全，用無血清的培養(yǎng)基稀釋給藥，使96孔板每孔化合物終濃度為5 μmol·L－1。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后加入20 μL 5 mg·mL－1MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄去上清液，加入150 μL DMSO，避光、低速震蕩至完全溶解。于490 nm波長下用酶聯(lián)免疫檢測儀測量吸光度（OD）值，重復(fù)3次，計算抑制率，結(jié)果見表1。

表1 目標(biāo)化合物的體外抗腫瘤活性Tab 1 Antitumor activities of the target compounds in vitro

由表1可知，在濃度為5 μmol·L－1時，4b、4f、5a、5c 4個化合物對4種腫瘤細(xì)胞具有一定的抑制作用，4-位N原子上烷基化后活性有所升高。為進(jìn)一步闡明構(gòu)效關(guān)系，后期將設(shè)計合成更多取代類型的2-三氟甲基-3-硝基-喹啉-4-胺類衍生物。

3 討論

3.1 合成部分

本文通過以4-甲氧基苯胺為起始原料，通過環(huán)化、硝化、氯代、偶聯(lián)、烷基化等反應(yīng)，設(shè)計合成新型3-硝基-喹啉-4-胺衍生物11個。在化合物2的合成中，為防止喹啉環(huán)3-位和5-位同時引入硝基，濃硝酸的當(dāng)量數(shù)應(yīng)嚴(yán)格控制在1.0～1.2 eq。在本文采用的3-硝基-喹啉-4-胺類化合物合成路線中，部分中間體只需簡單的沉淀法或萃取法純化（不需要進(jìn)行柱層析純化）即可直接用于下一步反應(yīng)，總收率較高。

3.2 小結(jié)

本文共合成了11個2-三氟甲基喹啉衍生物，并且以MTT法對其進(jìn)行了抗腫瘤活性測試，結(jié)果顯示化合物4b、4f、5a、5c對4種細(xì)胞株有一定的抑制活性。后續(xù)可通過引入不同取代基，如對6、7位和4位引入雜環(huán)進(jìn)行修飾，深入探討該類化合物抗腫瘤活性方面的構(gòu)效關(guān)系，以尋找高效低毒的喹啉類抗腫瘤衍生物。