黃連素對感染幽門螺桿菌小鼠胃黏膜上皮細胞損傷的影響

郭穎媛　馮強　楊運霞　馬新生　郭明霞　杜丹丹　佘延芬

摘要 目的：探究黃連素對幽門螺桿菌感染小鼠胃黏膜上皮細胞損傷的保護作用。方法：選取25只雄性BALB/c小鼠，隨機分為對照組，模型組，低劑量組，中劑量組，高劑量組，每組5只。其中對照組小鼠按0.2 mL/只灌胃生理鹽水和布氏肉湯，其他4組均以0.2 mL/只灌胃幽門螺桿菌NCTC11637菌液構(gòu)建幽門螺桿菌感染模型。低劑量組，中劑量組，高劑量組在建模后分別灌服25 mg/kg、50 mg/kg和100 mg/kg黃連素，1次/d，連續(xù)2周。對照組、模型組灌服5 mL/kg 0.5%羧甲基纖維素鈉;用CCK-8法評估小鼠胃黏膜上皮細胞活力;ELISA法檢測細胞上清IL-1β、IL-8、IL-4、IL-10的水平;流式細胞儀分析細胞凋亡率，免疫印跡法檢測細胞中Bax和Cl-caspase-3的表達。結(jié)果：與對照組比較，模型組的細胞活力顯著下降（P<0.05），而IL-1β、IL-8、IL-4、IL-10水平、細胞凋亡率以及Bax和Cl-caspase-3的表達均顯著增加（P<0.05）;與模型組比較，低、中、高劑量組的細胞活力明顯增加（P<0.05），而IL-1β、IL-8、IL-4、IL-10水平、細胞凋亡率以及Bax和Cl-caspase-3的表達均顯著降低（P<0.05）。結(jié)論：黃連素可減輕幽門螺桿菌感染對小鼠胃黏膜上皮細胞的炎性損傷。

關(guān)鍵詞 黃連素;幽門螺桿菌;炎癥介質(zhì);細胞凋亡;白細胞介素-1β;白細胞介素-8;胃黏膜;細胞活力

Abstract Objective：To explore the protective effects of berberine on the injury of gastric mucosal epithelial cells in mice model with helicobacter pylori.Methods：25 male BALB/c mice were selected and randomly divided into the control group，model group，low-dose experimental group，medium-dose experimental group and high-dose experimental group，with 5 in each group.The mice in the control group were given 0.2 mL/each with normal saline and brucella broth.The other four groups were all given 0.2 mL/each helicobacter pylori NCTC11637 bacterial solution to construct the helicobacter pylori infection model.After successful modeling，the low-dose experimental group，the middle-dose experimental group，and the high-dose experimental group were given 25 mg/kg，50 mg/kg and 100 mg/kg berberine，respectively.1 time per day for 2 consecutive weeks.The control group and model group were given sodium carboxymethyl cellulose solution at the dose of 5 mL/kg by gavage respectively.Mouse gastric mucosal epithelial cells viability was assessed using CCK-8.The levels of IL-1β，IL-8，IL-4，IL-10 in cell supernatant were detected by enzyme-linked immunoassay（ELISA）.Cell apoptosis were analyzed by flow cytometry.The expression of Bax and Cl-caspase-3 in the cells was detected by western blotting.Results：Compared with the control group，cell viability decreased significantly in the model group（P<0.05），while the contents of IL-1β，IL-8，IL-4，IL-10，apoptosis rate and expression of Bax and Cl-caspase-3 were significantly increased（P<0.05）.Compared with the model group，cell viability was significantly increased in low，medium and high dose groups（P<0.05），while the contents of IL-1β，IL-8，IL-4，IL-10，apoptosis rate and expression of Bax and Cl-caspase-3 were significantly decreased（P<0.05）.Conclusion：Berberine can reduce the inflammatory damage of helicobacter pylori infection on gastric mucosal epithelial cells in mice.

Keywords Berberine; Helicobacter pylori; Inflammatory factors; Apoptosis; Interleukin 1β; Interleukin 8; Gastric mucosal; Cell vitality

中圖分類號：R284;R392.5文獻標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.18.008

幽門螺旋桿菌是一種公認的病原體，世界上多達一半的人慢性感染幽門螺旋桿菌[1]，幽門螺旋桿菌是導(dǎo)致消化性潰瘍和慢性胃炎發(fā)生的重要原因，也是十二指潰瘍發(fā)生的啟動因子[2]。黃連素，又名小檗堿，屬異喹啉類生物堿，是植物黃連的根狀莖中提取的主要有效成分[3]。臨床上黃連素被用來治療消化性潰瘍、胃炎和消化性或感染性腹瀉等疾病[4]。最新研究表明，黃連素具有良好的抗菌、抗炎等作用[5]。有研究報道黃連素在多種疾病中均具有顯著的療效，例如宋菊敏等[6]在研究中發(fā)現(xiàn)黃連素可明顯降低糖尿病大鼠高胰島素血癥，改善脂類代謝障礙，同時黃連素還具有抗氧化作用。既往研究發(fā)現(xiàn)，黃連素對同為革蘭陰性桿菌的結(jié)核雙歧桿菌有較好的抑制作用[7]。然而關(guān)于黃連素對幽門螺桿菌作用機制的相關(guān)研究還未見報道。本研究將通過構(gòu)建幽門螺桿菌感染小鼠模型，并分離小鼠胃黏膜上皮細胞，探討黃連素對幽門螺桿菌感染小鼠胃黏膜上皮細胞的活力，炎癥介質(zhì)水平以及細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選取25只健康雄性BALB/c小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量為17～20 g，購自華北制藥股份有限公司。動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（冀）2019-004。溫度20～26 ℃，相對濕度40%～70%，明暗交替時間12 h/12 h。4只小鼠飼養(yǎng)于一個滅菌鼠籠，實驗期間自由飲水及采食，動物飼喂高壓滅菌全價顆粒飼料，飲用高壓滅菌酸化水。每周二、五稱取體質(zhì)量，并記錄數(shù)據(jù)。本研究經(jīng)邯鄲市中心醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（倫理審批號：201805003）。

1.1.2 菌株 幽門螺桿菌菌株NCTC 11637，購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。將幽門螺桿菌菌株NCTC11637置于厭氧罐中，在85% N2、10% CO2、5% O2，37 ℃的環(huán)境下培養(yǎng)48 h，用生理鹽水制成細菌懸液備用[8]。

1.1.3 藥物 黃連素（上海懋康生物科技有限公司，生產(chǎn)批號：YC49927471），HPLC（高效液相色譜法）測定含量≥98%。

1.1.4 試劑與儀器 胎牛血清（Gibco公司，美國，貨號：1921005PJ）;DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司，美國，貨號：A4192101）;細胞計數(shù)試劑盒-8（CCK-8）（Dojindo公司，日本，貨號：CK04）;IL-1β ELISA試劑盒（上海碧云天生物公司，貨號：PI305）;IL-8 ELISA試劑盒（上海碧云天生物公司，貨號：PI640）;Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒（上海碧云天生物公司，貨號：C1062M）;甲醛游離組織固定劑（上海西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司，貨號：A5472-1GAL）;切片石蠟（北京謹(jǐn)明生物科技有限公司，貨號：P10071-1kg）;兔抗Bax多克隆抗體（Abcam公司，美國，貨號：ab32503）;兔抗Cl-caspase-3多克隆抗體（Abcam公司，美國，貨號：ab2302）;兔抗β-actin多克隆抗體（Abcam公司，美國，貨號：ab8227）;山羊抗兔IgG二抗（Abcam公司，美國，貨號：ab150077）。多功能酶標(biāo)儀（TECAN公司，瑞士，型號：Spark）;流式細胞儀（BD公司，美國，型號：FACSCalibur）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將小鼠禁食12 h后，先用5%碳酸氫鈉溶液以0.2 mL/只灌胃，30 min后，幽門螺旋桿菌小鼠模型用幽門螺桿菌菌液按照0.2 mL/只灌胃，連續(xù)3次，每次間隔48 h的方法進行構(gòu)建;空白對照組小鼠模型用0.2 mL/只生理鹽水和布氏肉湯灌胃，連續(xù)3次，每次間隔48 h的方法處理。末次干預(yù)后處死幽門螺旋桿菌感染小鼠，取胃竇組織，進行快速尿素酶試驗和鏡檢，以快速尿素酶試劑檢測結(jié)果為陽性且胃黏膜出現(xiàn)慢性炎癥病理學(xué)改變?yōu)樵炷３晒9]。將25只小鼠隨機分為對照組，模型組，低劑量組，中劑量組，高劑量組，每組5只。

1.2.2 給藥方法 將黃連素與0.5%羧甲基纖維素鈉配制成25 mg/mL、50 mg/mL和100 mg/mL黃連素混懸液，現(xiàn)配現(xiàn)用[10]。對照組、模型組按5 mL/kg灌服0.5%羧甲基纖維素鈉;低劑量觀察組，中劑量觀察組，高劑量觀察組按5 mL/kg灌服25 mg/mL、50 mg/mL和100 mg/mL黃連素混懸液，1次/d，連續(xù)2周，隨后按照參考文獻[11]方法，從各組小鼠胃黏膜中分離制取胃黏膜上皮細胞，用于后續(xù)實驗。

1.2.4 檢測指標(biāo)與方法

1.2.4.1 蘇木精-伊紅（HE）染色檢測各組小鼠胃黏膜組織病理 對各組小鼠進行安樂死處理，取胃組織，用含有甲醛（10%）溶液進行固定，然后分別用從低濃度到高濃度的乙醇進行脫水，將組織置于二甲苯中透明，再將已經(jīng)透明過的組織放入石蠟中，待石蠟完全把組織包埋后進行冷卻。之后將包埋后的石蠟塊進行切片，然后使用HE染色法進行染色，并在光鏡下觀察[13]。

1.2.4.2 用CCK-8法檢測細胞成活率 取1.2.2分離的各組小鼠胃黏膜上皮細胞，使用胰蛋白酶消化制成2×105個/mL的細胞懸液。以每孔100 μL細胞懸液接種于96孔板。向每孔加入10 μL的CCK-8試劑，并設(shè)置只含培養(yǎng)基和CCK-8試劑的空白孔。將培養(yǎng)板37 ℃孵育90 min后，用多功能酶標(biāo)儀在450 nm波長下讀取吸光度（A）值[14]。計算細胞成活率：細胞成活率（%）=（實驗孔A值-空白孔A值）/（對照孔A值-空白孔A值）×100%。

1.2.4.3 用酶聯(lián)免疫吸附試驗法（ELISA）檢測細胞炎癥介質(zhì)的水平 取1.2.2分離的各組小鼠胃黏膜上皮細胞。按照操作說明書，分別使用IL-1β和IL-8 ELISA試劑盒檢測各組細胞上清液IL-1β和IL-8的水平[15]。

1.2.4.4 用流式細胞術(shù)測定細胞凋亡 取1.2.2分離的各組小鼠胃黏膜上皮細胞，用胰蛋白酶消化并用4 ℃磷酸鹽緩沖液重懸細胞，加入100 μL Annexin V-FITC結(jié)合緩沖液重懸細胞。加入5 μL AnnexinV-FITC，37 ℃下避光孵育15 min后，再加入5 μL碘化丙啶（PI）作用5 min后，上機檢測各組細胞的凋亡[16]。

1.2.4.5 用蛋白免疫印跡法（Western Blotting）檢測Bax和Cl-caspase-3蛋白表達水平 取1.2.2分離的各組小鼠胃黏膜上皮細胞，按照每106個細胞加入20 μL的RIPA裂解液，30 min后，按照文獻[12]的離心速度離心后，使用BCA法檢測蛋白水平，然后進行凝膠電泳分離蛋白，進行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜后用5%的脫脂牛奶進行室溫封閉，之后加入Bax（1∶500）、Cl-caspase-3（1∶1 000）和β-actin一抗（1∶500）進行孵育，4 ℃孵育過夜，加入二抗（1∶2 000）室溫孵育，之后加入顯色液進行檢測[15]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間差異比較用單因素方差分析，使用LSD-t進行兩兩比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃連素對幽門螺桿菌感染小鼠組織病理學(xué)的影響 空白組的胃黏膜上皮組織結(jié)構(gòu)較為完整，腺體排列整齊。與空白組比較，模型組的小鼠胃黏膜上皮組織破壞，鏡下可見上皮細胞壞死、脫落。見圖1。

2.2 黃連素對幽門螺桿菌感染的小鼠胃黏膜上皮細胞活力的影響 模型組與空白組比較，低、中、高劑量觀察組與模型組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05）。見表1。

2.3 黃連素對幽門螺桿菌感染的小鼠胃黏膜上皮細胞上清液中炎癥介質(zhì)水平的影響 與空白組比較，模型組上清液中IL-1β，IL-8，IL-4，IL-10的水平均顯著升高（P<0.05）;與模型組比較，低、中、高劑量組上清液中IL-1β和IL-8，IL-4，IL-10的水平均顯著降低（P<0.05）。見表2。

2.4 黃連素對幽門螺桿菌感染的小鼠胃黏膜上皮細胞凋亡的影響 與對照組比較，模型組細胞凋亡率、Bax和Cl-caspase-3蛋白表達水平均顯著增加（P<0.05）;與模型組比較，低、中、高劑量觀察組細胞的凋亡率、Bax和Cl-caspase-3蛋白表達水平顯著降低（均P<0.05）。見表3，圖2～3。

3 討論

幽門螺旋桿菌感染能使胃和十二指腸產(chǎn)生炎癥，使感染宿主產(chǎn)生免疫反應(yīng)，使胃黏膜細胞變性、壞死、炎癥細胞浸潤[17]。目前，臨床上治療幽門螺旋桿菌的方法多采用類似阿莫西林和克拉霉素等抗生素以及質(zhì)子泵抑制劑，然而對幽門螺桿菌的療效卻不理想，因此尋找新的治療幽門螺旋桿菌的藥物十分重要。黃連素又稱小檗堿，是中藥黃連的主要有效成分[18]，黃連素的藥理作用已得到證實[19]。研究發(fā)現(xiàn)黃連素在治療幽門螺旋桿菌感染的消化性潰瘍有顯著的療效[20]。田華等[21]研究發(fā)現(xiàn)黃連素可通過調(diào)控ROS/ERK1/2信號通路使胃黏膜免受幽門螺旋桿菌感染帶來的損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，幽門螺旋桿菌可抑制促進胃黏膜上皮細胞的活性，但黃連素可提高幽門螺旋桿菌對胃黏膜上皮細胞活力的抑制，表明黃連素可通過促進胃黏膜上皮細胞成活率的途徑改善幽門螺旋桿菌對胃黏膜上皮細胞的損傷，這與田華等[21]的研究結(jié)果相似。

IL-1β是主要由內(nèi)皮細胞或單核細胞生成的一種白細胞介素1的亞型，IL-1β在機體免疫應(yīng)答中扮演著重要的角色。研究發(fā)現(xiàn)IL-8，IL-4，IL-10也參與調(diào)控機體的炎癥反應(yīng)[22-23]。郭輝等[24]在研究中發(fā)現(xiàn)，幽門螺旋桿菌感染后，胃癌患血清中IL-1β和IL-8的表達顯著增加，且劉東亞等[25]也通過實驗證實了IL-1β在幽門螺旋桿菌感染的胃黏膜組織中顯著高表達。在本研究中發(fā)現(xiàn)，幽門螺旋桿菌感染后，小鼠胃黏膜上皮細胞中IL-1β，IL-8，IL-4，IL-10的表達顯著升高，這與劉學(xué)仁[23]和郭輝等[24]的研究結(jié)果一致。研究發(fā)現(xiàn)黃連素具有一定的抗炎功效[5]，本研究對幽門螺旋桿菌感染的胃黏膜上皮細胞給予不同濃度的黃連素處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃連素可顯著抑制幽門螺旋桿菌感染的胃黏膜上皮細胞中IL-1β，IL-8，IL-4，IL-10的表達，表明黃連素可抑制幽門螺旋桿菌感染導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)。

胃黏膜上皮細胞凋亡是消化系統(tǒng)疾病發(fā)生和發(fā)展的重要途徑[26]，本研究通過對胃黏膜上皮細胞凋亡情況的檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)幽門螺旋桿菌可顯著促進胃黏膜上皮細胞凋亡，而黃連素可顯著逆轉(zhuǎn)幽門螺旋桿菌對胃黏膜上皮細胞凋亡的影響，提示黃連素可通過抑制胃黏膜上皮細胞凋亡的途徑改善幽門螺旋桿菌感染的損傷。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)黃連素可通過促進胃黏膜上皮細胞成活率，抑制胃黏膜上皮細胞凋亡和炎癥反應(yīng)的途徑減輕幽門螺旋桿菌對胃黏膜上皮細胞的損傷，本研究為臨床治療幽門螺旋桿菌提供了可參考的理論依據(jù)。

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（2021-07-06收稿 責(zé)任編輯：楊覺雄）