乳及乳制品中磷脂的含量、功能、分離及檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

胡 雪，段國(guó)霞，劉麗君，李翠枝，呂志勇，唐 爍

（內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110）

磷脂是一類含有磷酸基團(tuán)的脂質(zhì)，其廣泛存在于植物油、大豆、蛋黃、乳制品、肉類中[1-2]。磷脂也是一類被熟知的極性脂類，根據(jù)其主體碳鏈結(jié)構(gòu)的不同，可主要分為甘油磷脂和鞘磷脂兩大類[3-4]。甘油磷脂主要包含了磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine，PC）、磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）、磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI）和磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS），鞘磷脂則主要為神經(jīng)鞘磷脂（sphingomyelin，SM）。除了以上常見(jiàn)的5 種磷脂外，學(xué)者們還發(fā)現(xiàn)了一些微量磷脂成分，如磷脂酸（phosphatidic acid，PA）、磷脂酰甘油（phosphatidylglycerol，PG）、溶血磷脂酰膽堿（lysophosphatidylcholine，LPC）、溶血磷脂酰乙醇胺（lysophosphatidylethanolamine，LPE）、縮醛磷脂、葡糖神經(jīng)酰胺（glucoceramide，GluCer）和乳糖神經(jīng)酰胺（lactose ceramide，LacCer），其中GluCer和LacCer都屬于鞘磷脂，LPC和LPE分別為PC和PE的代謝產(chǎn)物[5-8]。磷脂在乳中的存在形式為乳脂肪球滴，是乳脂肪球膜（milk fat globule membrane，MFGM）的主要組成物質(zhì)，由于其兩親性特征，磷脂在乳中起到了維持乳脂物理穩(wěn)定性的作用，也通常被用作乳化劑添加到食品中[9-11]。磷脂種類繁多，因擁有多種同分異構(gòu)體和異形物，使得其檢測(cè)方法異常復(fù)雜。目前，GB 5009.272—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇的測(cè)定》闡述了使用紫外檢測(cè)器測(cè)量食品中PC、PE和PI的方法，GB/T 35867—2018《糧油檢測(cè) 卵磷脂中磷脂含量的測(cè)定》高效液相色譜蒸發(fā)光散射檢測(cè)法和ISO 11701-2009Vegetable fats and oils-Determination of phospholipids content in lecithins by HPLC using a light-scattering detector闡述了使用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（evaporative light scattering detector，ELSD）測(cè)定卵磷脂中磷脂含量的方法。然而，以上標(biāo)準(zhǔn)的適用范圍為大豆磷脂、大豆油、花生油等基質(zhì)，并不包含乳及乳制品。國(guó)外有部分學(xué)者對(duì)食品包括乳品中磷脂的含量、分布和檢測(cè)手段發(fā)表了一些綜述[7-10]，但檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展日新月異，文獻(xiàn)報(bào)道往往具有其時(shí)限性；國(guó)內(nèi)就此領(lǐng)域發(fā)表的相關(guān)報(bào)道不多，針對(duì)乳制品基質(zhì)的更是少之又少。基于以上事實(shí)，本文就最近20 年（2000—2020年）發(fā)表的關(guān)于乳及乳制品中磷脂分布、含量、功能性、分離提取、檢測(cè)手段的相關(guān)學(xué)術(shù)報(bào)道進(jìn)行了細(xì)致而全面的綜述，以期為相關(guān)檢測(cè)行業(yè)提供技術(shù)參考。近年來(lái)，眾多嬰幼兒食品企業(yè)已將磷脂作為營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑添加入配方乳粉中，但磷脂成分標(biāo)識(shí)缺乏完整的信息，且國(guó)內(nèi)外針對(duì)乳制品中磷脂含量的相關(guān)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)仍未頒布，其含量與標(biāo)識(shí)值是否一致也無(wú)從驗(yàn)證。因此，梳理和總結(jié)乳及乳制品中磷脂類化合物的檢測(cè)手段對(duì)乳制品行業(yè)具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。

1 乳及乳制品中磷脂的含量

1.1 母乳中磷脂的含量

隨著近年來(lái)分析化學(xué)的發(fā)展，母乳中磷脂的含量和組成被來(lái)自中國(guó)、西班牙、法國(guó)、新加坡和馬來(lái)西亞等國(guó)家的科研團(tuán)隊(duì)報(bào)道。概括來(lái)說(shuō)，磷脂在母乳中的質(zhì)量濃度為13.3～40.6 mg/100 mL，占乳脂的比例為0.4%～1.4%[12-17]，各組分所占比例為PC：16.8%～28.5%；PE：9.3%～40.0%；SM：24.0%～45.9%；PI：2.0%～9.5%；PS：2.6%～16.7%。可以看出；母乳中含量最多的磷脂為SM；其次為PE和PC。多篇文獻(xiàn)指出母乳中磷脂含量會(huì)隨著母親所處的泌乳階段、飲食習(xí)慣和所處地區(qū)發(fā)生顯著改變，一些研究人員對(duì)母親在不同泌乳時(shí)期（初乳期、過(guò)度乳期、成熟乳期）所產(chǎn)乳中磷脂含量的變化進(jìn)行了研究[17-20]，其中Ma Lin等[18]的結(jié)果顯示初乳、過(guò)度乳和成熟乳中磷脂總量分別為32.7、26.3、21.5 mg/100 g，表明乳中磷脂含量會(huì)隨著泌乳時(shí)間的遞增而呈遞減趨勢(shì)；而母親的年齡通常不是影響母乳中磷脂含量的顯著因素，但早產(chǎn)兒母親所產(chǎn)的乳中磷脂含量會(huì)比足月兒更低[20]。來(lái)自不同國(guó)家的母親所產(chǎn)乳中磷脂含量也存在顯著差異，這主要是由各自不同的飲食習(xí)慣所引起的。例如，日本的母親長(zhǎng)期以來(lái)有著攝入大量海產(chǎn)品的飲食習(xí)慣，她們所產(chǎn)的母乳中可能含有更高的PE，因?yàn)樯詈ｔ~(yú)蝦中富含多種組成該類磷脂的不飽和脂肪酸；而來(lái)自中國(guó)的母親會(huì)在生產(chǎn)后的第一個(gè)月補(bǔ)充大量的雞蛋、魚(yú)類和其他肉類食品，俗稱“坐月子”，她們所產(chǎn)的母乳中可能也會(huì)含有較高的PE，因?yàn)殡u蛋中富含PE[21]。

1.2 牛乳中磷脂的含量

近年來(lái)也有諸多文獻(xiàn)對(duì)牛乳中磷脂的含量和分布進(jìn)行了分析和總結(jié)。通常，磷脂在牛乳中的質(zhì)量濃度為4.6～49.1 mg/100 mL，其在乳脂中的相對(duì)含量為0.2%～1%[22]，其各組分相對(duì)含量為PC：19.1%～36.6%，PE：22.6%～42.0%，SM：17.0%～41.1%，PI：2.9%～9.3%，PS：1.7%～10.5%。與母乳不同的是，牛乳中含量最多的磷脂是PE，其次是SM和PC。一般認(rèn)為導(dǎo)致牛乳中磷脂含量差異的因素包括品種、年齡、季節(jié)、地域、飼料配比、泌乳階段、飼養(yǎng)模式和加工工藝等。飼料一般是造成牛乳中磷脂差異的最主要因素，調(diào)整飼料配比（如添加精飼料或含油種子）會(huì)造成牛乳中不飽和脂肪酸比例的改變，從而引起部分磷脂分子種類的改變[23-25]。牛品種也可能影響乳中磷脂指標(biāo)，如Bitman[26]和Graves[27]等對(duì)比了娟姍牛和荷斯坦牛所產(chǎn)乳中磷脂的含量差異，Bitman等指出荷斯坦牛所產(chǎn)乳中磷脂含量更高，而娟姍牛所產(chǎn)乳中甘油三酯含量更高[26]，Graves等則進(jìn)一步研究了造成這種差異的原因，指出這是因?yàn)楹伤固古５娜橹厩蝮w積更小，具有更大的球膜表面積，因此含有更多的磷脂[27]。除此之外，經(jīng)過(guò)滅菌工藝處理的牛乳，其磷脂含量會(huì)比生牛乳低，如Rombaut等[8]測(cè)得生牛乳中的磷脂總含量為29.4 mg/100 g，經(jīng)過(guò)巴氏殺菌和超高溫瞬時(shí)滅菌（ultrahigh temperature instantaneous sterilization，UHT）工藝處理后的牛乳分別含18.8 mg/100 g和21.2 mg/100 g磷脂，一個(gè)潛在因素可能是高溫造成不飽和脂肪酸改變而引發(fā)磷脂含量的差異；Reis等[28]在其實(shí)驗(yàn)中也驗(yàn)證了這一點(diǎn)，當(dāng)熱處理過(guò)程中溫度設(shè)定為80 ℃時(shí)，PC（28∶0）和PE（36∶1）含量發(fā)生顯著下降，作者認(rèn)為是磷脂在高溫下發(fā)生糖化和降解導(dǎo)致的。其他因素如飼養(yǎng)模式也會(huì)影響牛乳中磷脂的含量，Avalli[29]和Donato[30]等對(duì)意大利地區(qū)不同牧場(chǎng)的牛乳進(jìn)行了磷脂含量檢測(cè)，二者檢測(cè)的牛乳中磷脂總量分別為9.3 mg/100 g和4.6 mg/100 mL，原因可能是不同牧場(chǎng)配置影響牛的生長(zhǎng)環(huán)境，從而間接地影響牛的免疫力和產(chǎn)奶品質(zhì)。

1.3 嬰幼兒配方乳粉中磷脂的含量

除了對(duì)液態(tài)哺乳動(dòng)物乳的研究，諸多學(xué)者還對(duì)市售嬰幼兒配方乳粉中磷脂的含量進(jìn)行了分析。磷脂在嬰配粉中的含量為15～607 mg/100 g，各組分分別為PC：33.2～253.1 mg/100 g，PE：19.2～143.2 mg/100 g，SM：12.0～125.0 mg/100 g，PI：13.6～110.0 mg/100 g，PS：12.6～75.0 mg/100 g。不同產(chǎn)地、生產(chǎn)商、甚至生產(chǎn)日期都會(huì)影響嬰配粉中磷脂含量的差異，因?yàn)槠渲猩婕傲瞬煌呐浞?、原料和加工工藝；即使同一品牌的嬰配粉，通常根?jù)嬰兒年齡差異區(qū)分了不同的產(chǎn)品類別，因?yàn)閶雰涸诿恳粋€(gè)年齡段的營(yíng)養(yǎng)需求不同。例如，一段（0～6月齡）嬰配粉是為了代替母乳，所以配方力求接近母乳；二段（6～12月齡）嬰配粉通常已不是嬰兒唯一的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，所以配方中的營(yíng)養(yǎng)素配比會(huì)適當(dāng)調(diào)整。Liu Zhiqian等[31]對(duì)澳大利亞、加拿大和美國(guó)等地區(qū)產(chǎn)的32 種嬰兒配方粉中的PI進(jìn)行了分析，結(jié)果表明同一月齡嬰配粉中PI含量差異不大，但不同月齡段嬰配粉中PI含量差異顯著，如一段配方粉中PI含量為37～38 mg/100 g，而二段配方粉中PI含量為115～120 mg/100 g。目前市售的嬰配粉原料多為乳清蛋白粉，也有部分使用原奶進(jìn)行噴粉，所以原料中磷脂的含量存在顯著差異；在進(jìn)行磷脂強(qiáng)化時(shí)，大部分廠家使用MFGM和大豆磷脂，也有部分使用其他牛乳磷脂濃縮物或蛋黃卵磷脂，故強(qiáng)化劑里磷脂的含量也存在差異[32-34]。Jiang Chenyu等[32]對(duì)4 種不同廠商的嬰配粉進(jìn)行磷脂含量分析，結(jié)果顯示磷脂總量介于15.0～227.4 mg/100 g，而Fong等[33]調(diào)研的7 種嬰配粉中磷脂含量介于228～607 mg/100 g，這個(gè)較大的差異區(qū)間就是以上多種因素共同導(dǎo)致的。

本綜述總結(jié)了先前研究中乳及乳制品中磷脂的組分和含量，如表1所示。

表1 乳及乳制品中磷脂的組分和含量Table1 Phospholipid composition of milk and milk products

續(xù)表1

2 乳及乳制品中磷脂的功能性

磷脂是乳中一項(xiàng)重要的功能性營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)，因其多項(xiàng)生理活性而受到廣泛關(guān)注，近年來(lái)，磷脂越來(lái)越多地被用于功能性食品添加劑和嬰兒配方乳粉中的營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑[3,34]。早在20世紀(jì)初期，膳食性磷脂對(duì)心臟疾病、炎癥和癌癥患者的保健作用就引起了眾多學(xué)者的關(guān)注[5]，尤其是神經(jīng)鞘磷脂，其代謝產(chǎn)物如神經(jīng)酰胺和鞘胺醇在細(xì)胞調(diào)控方面起到了顯著的作用，被認(rèn)為是最具生物活性的物質(zhì)之一[56-64]。目前，磷脂在降膽固醇、提高肝功能和降低心腦血管疾病方面展現(xiàn)了強(qiáng)大的功效，其他生物活性還包括抗氧化、抗炎、抗菌和抗病毒等[16]。除了針對(duì)成年人的眾多保健功效，磷脂在建立嬰兒大腦神經(jīng)系統(tǒng)、腸道免疫系統(tǒng)和胃腸消化系統(tǒng)等方面也起到了不可或缺的作用[41-45]。磷脂中的SM和PC被認(rèn)為是磷脂中最具價(jià)值的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，因?yàn)閶雰荷L(zhǎng)必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)膽堿，有接近17%來(lái)源于這部分磷脂成分，這類營(yíng)養(yǎng)素是維持嬰兒快速發(fā)育及合成體內(nèi)生物膜必不可少的物質(zhì)[13]。而磷脂中的PE可為嬰兒提供花生四烯酸、二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸等不飽和脂肪酸，這類營(yíng)養(yǎng)素能顯著提高嬰兒的大腦和視力發(fā)育[63]。

然而，在無(wú)法提供母乳喂養(yǎng)的情況下，配方乳粉則成為嬰兒獲取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的唯一途徑，因此，配方乳粉中的各項(xiàng)營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)應(yīng)最大化地與母乳相近，以達(dá)到為新生兒提供健全營(yíng)養(yǎng)保障的目的。目前，市售的嬰兒配方乳粉通常由牛乳或羊乳制成，其磷脂含量與人乳存在顯著差異，了解母乳的營(yíng)養(yǎng)成分是研發(fā)嬰兒配方乳粉的基礎(chǔ)，而了解不同種類的乳中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量的差異，能為合理選擇嬰兒配方乳粉的原料提供參考，也能為縮小配方乳粉與嬰兒營(yíng)養(yǎng)需求的差異提供科學(xué)依據(jù)[48-49]。僅本文綜述的文獻(xiàn)結(jié)果顯示，母乳中磷脂總量介于13.3～40.6 mg/100 mL，嬰配粉中磷脂總量為15～607 mg/100 g。需要指出的是，嬰配粉屬于特殊配方食品，由于原料、配方和噴粉工藝的不同，其磷脂含量較母乳而言存在更為顯著的差異；且嬰配粉為濃縮乳制品，其通常需要與水進(jìn)行一定比例的復(fù)溶，故嬰配粉和母乳中磷脂的含量不具備直接可比性。嬰配粉與母乳中磷脂組成的差異主要體現(xiàn)在PC和SM上，母乳中通常SM含量比PC高，而嬰配粉中則是PC含量比SM高，這可能是由于嬰配粉以大豆磷脂為原料進(jìn)行磷脂強(qiáng)化，大豆磷脂富含PC而僅含少量SM[13,33]。

3 乳及乳制品中磷脂的提取和分離

乳及乳制品中包含眾多種類的糖、脂肪及蛋白質(zhì)，是一類非常復(fù)雜的基質(zhì)，如何高效地提取、分離及回收磷脂是該領(lǐng)域值得研究的課題。乳制品中磷脂的檢測(cè)前處理通常包括以下幾個(gè)步驟：提取乳中脂肪，將磷脂與乳脂中其他脂類分離并回收磷脂。

乳中總脂肪的提取方法有很多，目前運(yùn)用最廣泛的是Folch法[65]。Folch法使用的提取溶劑為氯仿和甲醇按體積比2∶1配成的混合溶液，通常以20 倍體積加入待測(cè)乳制品液態(tài)試樣中，萃取液中隨后加入鹽溶液直至水相與有機(jī)相分離，乳脂即可被收集。分析化學(xué)家協(xié)會(huì)隨后也發(fā)表了總脂肪的提取方法[66]，但該法使用了氨水這類的堿性溶劑，并需要將樣品加熱至溶液蒸發(fā)，該法會(huì)導(dǎo)致部分磷脂水解或被氧化，所以總體效果不如Folch法。

順利提取乳脂后，便需要將磷脂與乳脂中非目標(biāo)脂類分離，主要是去除乳脂中的甘油三酯和其他中性脂肪。這一步的難點(diǎn)在于磷脂在乳脂中含量非常低（0.5%～1%），且與乳中各類化合物存在多種相互作用力，想要盡可能多地回收磷脂通常需要借助一些外界手段，行之有效的方法包括層析柱或固相萃?。╯olid phase extraction，SPE）小柱[67-69]。層析柱使用起來(lái)費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且需耗費(fèi)大量的有機(jī)溶劑，目前已多被更快捷、環(huán)保、高效的SPE小柱取代[52-54]。典型的SPE小柱使用步驟包括：注入正己烷或氯仿溶液將SPE硅膠柱活化，在加入提取液后，使用己烷/乙醚混合液淋洗中性脂肪，再用氯仿/甲醇/水混合液洗脫并收集磷脂，最后復(fù)溶至上機(jī)溶液。Gallier等[49]對(duì)比了3 種SPE方法（Bitman法[70]、Avalli法[29]和Vaghela法[71]）對(duì)磷脂回收效率的影響，3 種方法的區(qū)別在于活化液、淋洗液和洗脫液溶劑的選擇和配比上。結(jié)果顯示Bitman法得到了最高的磷脂提取率（33.6 nmol/mg lipid），次之為Avalli法（29.6 nmol/mg lipid）和Vaghela法（20.7 nmol/mg lipid）。Avalli等[29]研究了填料分別為硅膠和C8的SPE小柱對(duì)磷脂分離效果的影響，結(jié)果顯示硅膠柱對(duì)于磷脂的分離效果更佳。在依次使用2 mL甲醇和2 mL氯仿-甲醇-水（體積比為3∶5∶8）為洗脫液的條件下，磷脂回收率能達(dá)96%，而相同條件下使用C8柱的結(jié)果僅為47.5%，作者推測(cè)C8柱的低回收率是由于磷脂部分功能基團(tuán)與SPE小柱填料發(fā)生相互作用，導(dǎo)致其未能完全洗脫。Contarini等[5]在其綜述中對(duì)比了4 種常用于磷脂分離的固相小柱填料（硅膠、氨基、C8和C18），多數(shù)情況下硅膠小柱的分離效果明顯優(yōu)于其他類型小柱，僅有Caboni等[72]研究顯示C8柱分離效果最佳。

除了上述的傳統(tǒng)填料，近年來(lái)學(xué)者們開(kāi)發(fā)了越來(lái)越多的新型填料，如高分子復(fù)合材料、納米材料、金屬氧化物結(jié)合硅膠的復(fù)合材料和介孔材料等[52-54,59-61,73-77]。Ten-Doménech等[68]于2017年發(fā)表了一項(xiàng)應(yīng)用于母乳中磷脂分離的新技術(shù)，將近年來(lái)的熱門的分子印跡聚合物與SPE柱結(jié)合，定向移除乳脂中非目標(biāo)化合物。該技術(shù)強(qiáng)調(diào)特異性綁定移除，與普通SPE柱存在一定的區(qū)別，且填料經(jīng)過(guò)一定處理后可重復(fù)使用。目前，該技術(shù)的檢出限比傳統(tǒng)SPE小柱略高，但其或?qū)镾PE技術(shù)的發(fā)展提供一種更智能、環(huán)保、低成本且高效益的新思路。

4 乳及乳制品中磷脂的定量檢測(cè)技術(shù)

所有檢測(cè)方法的相關(guān)信息已列至表2，下文將對(duì)4 種主流方法進(jìn)行詳細(xì)闡述。

表2 乳及乳制品中磷脂的主要檢測(cè)手段Table2 Popular quantification techniques for phospholipids in milk and milk products

4.1 薄層色譜法

薄層色譜法（thin layer chromatography，TLC）是根據(jù)展開(kāi)劑中磷脂各組分與薄層板上吸附劑之間作用力不同、比移值（retardation factor，Rf）不同而達(dá)到分離磷脂組分目的的一種檢測(cè)手段[86]，TLC通常用于磷脂的定性和半定量測(cè)定，是最早應(yīng)用于磷脂檢測(cè)的方法之一[13,87]。TLC的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單、快速、直觀、專業(yè)要求低、前期設(shè)備資金投入少，但其自動(dòng)化程度低，多數(shù)情況下適用于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的檢測(cè)，難以應(yīng)用到工業(yè)界大規(guī)模樣品的批檢中。Morrison[88]、Christie[89]、Weihrauch[90]等在20世紀(jì)60—80年代開(kāi)始研究TLC及2D-TLC對(duì)乳及乳制品中磷脂含量的檢測(cè)，檢測(cè)基質(zhì)包括母乳、牛乳、水牛乳、羊乳、山羊乳、駱駝乳、驢乳和奶酪等，報(bào)道列出了5 類磷脂（PE、PI、PS、PC、SM）在各動(dòng)物基乳中的含量，其含量和其他檢測(cè)手段得出的結(jié)果基本屬于同一范圍。Sánchez-Juanes等[85]在2009年報(bào)道使用一種更先進(jìn)的HPTLC技術(shù)對(duì)生牛乳進(jìn)行磷脂組分分析。近年來(lái)，隨著儀器的革新和技術(shù)的發(fā)展，TLC在國(guó)內(nèi)外磷脂類化合物的檢測(cè)中已較少使用，取而代之的是更少受人為因素影響的色譜儀、質(zhì)譜儀和核磁共振儀等精密儀器[86]。

4.2 高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法

高效液相色譜（high-performance liquid chromatography，HPLC）法用于磷脂檢測(cè)的技術(shù)在近些年得到飛速進(jìn)步，并獲得了廣泛的認(rèn)可和應(yīng)用。HPLC法的突出優(yōu)點(diǎn)在于其能使非揮發(fā)性的、熱敏感的磷脂在常溫得到分離，且其封閉系統(tǒng)能最大限度地減少磷脂在分析過(guò)程中被氧化的程度，確保實(shí)現(xiàn)磷脂快速、靈敏、準(zhǔn)確、可重復(fù)的定量分析[87]。HPLC可配置多種檢測(cè)器，包括紫外檢測(cè)器（ultraviolet，UV）、ELSD、電荷氣溶膠探測(cè)器（charged aerosol detector，CAD）和質(zhì)譜儀（mass spectrometer，MS）等，其中，ELSD和MS應(yīng)用最為廣泛。

ELSD的檢測(cè)原理是將揮發(fā)性高的流動(dòng)相噴入帶熱氣流的檢測(cè)器中，待其蒸發(fā)后，不揮發(fā)的磷脂形成微小液滴，這些液滴散射的光進(jìn)入光電倍增器后產(chǎn)生電流，依據(jù)不同質(zhì)量的磷脂引起電流大小的差異來(lái)達(dá)到檢測(cè)的目的[2]。ELSD是一種相對(duì)新型的檢測(cè)器，它與UV、CAD和MS相比擁有諸多優(yōu)點(diǎn)，如適用范圍寬、檢測(cè)時(shí)不存在基線漂移、對(duì)溶劑流速不敏感、能消除流動(dòng)相梯度洗脫對(duì)結(jié)果帶來(lái)的不良影響等，其在乳制品等復(fù)雜基質(zhì)領(lǐng)域有很強(qiáng)的應(yīng)用，正在逐漸成為磷脂分析檢測(cè)的主流方法[5,34]。國(guó)際卵磷脂和磷脂協(xié)會(huì)于2003年推薦HPLCELSD法用于測(cè)量卵磷脂中的磷脂組分[51]，美國(guó)油脂化學(xué)家協(xié)會(huì)（American Oil Chemists’ Society，AOCS）也在2007年將HPLC-ELSD法收錄為分析卵磷脂的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法[91]。

近年來(lái)，諸多學(xué)者使用ELSD法對(duì)各類乳品基質(zhì)中的磷脂進(jìn)行了定量分析，產(chǎn)品品類上涵蓋了工藝滅菌乳（巴殺乳和UHT乳）、嬰幼兒配方乳粉、成人乳粉、奶油、黃油、白脫牛奶、奶酪、乳清蛋白粉、磷脂濃縮物、MFGM等；乳的種類上涵蓋了母乳（初乳、過(guò)度乳、成熟乳）、牛乳、羊乳、驢乳等；被檢測(cè)的磷脂分量涵蓋了PE、PI、PS、PC、SM、LPE、LPC、GluCer、LacCer等[8,28-29,33,35-36,53,62-64,66,68-69,71-72,88-89]。

HPLC-ELSD法在流動(dòng)相體系的選擇上主要包含兩大類：氯仿-甲醇-緩沖液/水體系和正己烷-異丙醇-緩沖液/水體系，后者極性比前者稍弱，目前GB/T 35867—2018《糧油檢驗(yàn) 卵磷脂中磷脂含量的測(cè)定》中介紹了使用ELSD搭配正己烷-異丙醇-緩沖液/水體系為流動(dòng)相檢測(cè)磷脂，除此之外，也有少部分文章報(bào)道了使用乙腈-甲醇-水體系的流動(dòng)相。HPLC-ELSD在色譜柱的選擇上主要為正向柱，絕大部分填料為硅膠或硅膠等效材料（如二醇基鍵合硅膠），洗脫條件通常為梯度洗脫，儀器和色譜柱的選擇已統(tǒng)一歸納至表2。有部分文獻(xiàn)中的實(shí)驗(yàn)對(duì)檢測(cè)方法進(jìn)行了優(yōu)化和驗(yàn)證，如Vila等[34]開(kāi)發(fā)了一項(xiàng)使用HPLC-ELSD對(duì)母乳和嬰幼兒配方乳粉中磷脂組分（PE、PI、PS、PC、SM）進(jìn)行分析的方法，并從流動(dòng)相配比和儀器運(yùn)行溫度兩方面對(duì)方法進(jìn)行了優(yōu)化，從線性關(guān)系、重復(fù)性、檢出限和定量限4 個(gè)方面對(duì)方法進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果指出在使用異丙醇-正己烷-水溶液（55∶37.2∶7.8，V/V/V）作為流動(dòng)相的體系中，測(cè)量溫度控制在85 ℃時(shí)，方法學(xué)驗(yàn)證的各項(xiàng)指標(biāo)達(dá)到最佳，此時(shí)回收率范圍為91.4%～107.9%，檢出限為9～76 ng，定量限為29～164 ng。

4.3 核磁共振磷譜

31P-NMR用于磷脂檢測(cè)是20世紀(jì)70—90年代發(fā)展成熟的技術(shù)，其在分析生理組織（大腦、肝臟、細(xì)胞膜等）和食品（植物油、肉類等）中磷脂含量的領(lǐng)域展現(xiàn)出了很強(qiáng)的應(yīng)用[90-97]。31P-NMR法具有很高的靈敏度，能檢出樣品中低濃度含量的磷脂，近年來(lái)，該方法也被開(kāi)發(fā)應(yīng)用于乳制品等復(fù)雜基質(zhì)[13,83]。31P-NMR的優(yōu)勢(shì)在于不需要對(duì)樣品進(jìn)行大量的化學(xué)處理，且定量分析時(shí)不需要標(biāo)準(zhǔn)品，只需在總脂肪中加入內(nèi)標(biāo)[63]。然而，31P-NMR儀器普及度不高，儀器運(yùn)營(yíng)費(fèi)用昂貴，對(duì)實(shí)驗(yàn)員操作的熟練程度也要求較高，所以在資金、人員、設(shè)備上投入相對(duì)較大[13,63]。31P-NMR的基本原理是檢測(cè)磷脂分子中的每個(gè)磷原子，基于各組分在不同的化學(xué)環(huán)境中會(huì)呈現(xiàn)出不同的31P化學(xué)位移，利用其31P核磁共振效應(yīng)來(lái)確定不同組分[47]。

Andreotti等[47]使用31P-NMR對(duì)牛乳和水牛乳中的磷脂進(jìn)行了定量分析，得出兩種乳中磷脂種類的分布大體一致的結(jié)論。Carcia等[22]采集了不同種類哺乳動(dòng)物（牛、駱駝、馬）乳中磷脂的指紋圖譜，并與人乳比對(duì)。結(jié)果顯示，人乳和駱駝乳中富含對(duì)嬰幼兒發(fā)育起到重要作用的神經(jīng)鞘磷脂（分別為7.83 mg/100 mL和11.8 mg/100 mL）和縮醛磷脂（分別為2.7 mg/100 mL和2.4 mg/100 mL）；磷脂總量在4 類乳中由高到低的排序?yàn)轳橊勅椋?.503 mmol/L）＞母乳（0.324 mmol/L）＞牛乳（0.265 mmol/L）＞馬乳（0.101 mmol/L）。Murgia等[7]鑒別和定量分析了羊乳乳脂和牛乳乳脂中的磷脂組分，文中引進(jìn)了單相二甲基甲酰胺/三乙基胺/鹽酸胍作為溶劑體系，相比于傳統(tǒng)的氯仿/甲醇/EDTA-水溶劑體系，新法能顯著提高譜圖峰的分辨率并降低化合物信號(hào)位移。MacKenzie等[51]對(duì)奶油、PC700（恒天然公司高磷脂含量的商業(yè)產(chǎn)品）、BPC60（恒天然公司的中性脫脂乳粉）中的PC、PE、PS、PI、SM含量進(jìn)行了檢測(cè)，并與2D-TLC法做出對(duì)比，兩種方法得出的磷脂組分基本屬于同一范圍。其中，奶油中磷脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.14%（TLC法）和0.16%（31P-NMR法）；PC700分別為53.2%（TLC法）和60.6%（31P-NMR法）；BPC60分別為72.9%（2D-TLC法）和75.8%（31P-NMR法）；結(jié)果顯示2D-TLC法靈敏性更高，能檢出31P-NMR無(wú)法檢出的低含量組分，但31P-NMR更適合高效率的規(guī)?；\(yùn)作，因其自動(dòng)化程度更高且耗時(shí)更短。

4.4 高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用

MS最大的優(yōu)勢(shì)在于其具有更高的精密度、靈敏性、特異性和更強(qiáng)的定性能力，它不僅可以檢測(cè)磷脂總量和分量，更可以精確到對(duì)各分子種類進(jìn)行定性和結(jié)構(gòu)分析。目前，MS被認(rèn)為是測(cè)定磷脂分量及分子種類最精確的手段，其結(jié)合三重四極桿或飛行時(shí)間MS將成為此領(lǐng)域新的發(fā)展方向。然而，MS儀器的購(gòu)買、運(yùn)行和維修費(fèi)用非常昂貴，且存在同位素峰間干擾和結(jié)果再現(xiàn)性不穩(wěn)定等問(wèn)題，故而其全面推廣受到限制。即便如此，磷脂檢測(cè)技術(shù)結(jié)合MS仍具有廣闊的前景，近些年涌現(xiàn)出大量針對(duì)乳制品應(yīng)用的報(bào)道。與液相色譜、核磁共振方法不同的是，質(zhì)譜儀通常串聯(lián)離子源（ESI、EI、電感耦合等離子體（inductively coupled plasma，ICP）等）、質(zhì)量分析器（四極桿、四極桿離子阱、飛行時(shí)間等）和檢測(cè)器（電子倍增器、感應(yīng)電荷檢測(cè)器等）共同使用，多種儀器組件的疊加增加了其檢測(cè)方法的復(fù)雜性。

通常，質(zhì)譜類檢測(cè)器使用的色譜柱多為反向柱（如C8、C18柱）或親水作用色譜（hydrophilic interaction liquid chromatography，HILIC）柱，使用的流動(dòng)相體系通常為氯仿-甲醇緩沖液或乙腈-甲醇緩沖液。值得一提的是，HILIC柱是一類既非正向柱也非反向柱的特殊色譜柱，其采用了類似正向柱的固定相，但具備反向柱的部分特征。HILIC柱是一類高效的極性物質(zhì)保留柱，通過(guò)親水性作用力實(shí)現(xiàn)對(duì)極性物質(zhì)的分離和洗脫，它能有效地改善反向色譜柱極性物質(zhì)保留性差的缺點(diǎn)，并能有效提高電噴霧離子源的靈敏度，近些年受到了越來(lái)越廣泛的關(guān)注[30]。

除此之外，質(zhì)譜類檢測(cè)器能對(duì)磷脂進(jìn)行精確地定性、定量分析，同時(shí)在數(shù)據(jù)分析時(shí)結(jié)合主成分分析（principal component analysis，PCA）能對(duì)磷脂進(jìn)行指紋圖譜的繪制。例如，Wang Lina等[81]使用UHPLC-Q-TOF-MS對(duì)母乳、牛乳和山羊乳中的PE、PG、PS、PI、PA、PC和SM進(jìn)行分析，結(jié)果顯示人乳中有36 種PE、28 種PC、20 種PS和17 種PI，且含量顯著高于牛乳和山羊乳，同時(shí)PCA結(jié)果表明不同哺乳動(dòng)物乳存在差異并可以通過(guò)PCA進(jìn)行區(qū)分，因此這項(xiàng)技術(shù)在食品真實(shí)性溯源領(lǐng)域擁有廣闊的發(fā)展前景。

質(zhì)譜類檢測(cè)器因擁有更高的檢測(cè)精度，部分學(xué)者探究了其高精度是否會(huì)帶來(lái)檢測(cè)結(jié)果的差異。如Tavazzi等[38]對(duì)比了HPLC-MS/MS、31P-NMR和HPLC-ELSD 3 種方法用于母乳和嬰配粉中磷脂的檢測(cè)，結(jié)果表明HPLC-MS/MS和31P-NMR得到的結(jié)果無(wú)顯著差異（P＞0.05），而HPLC-MS/MS和HPLC-ELSD僅在得到的PE含量結(jié)果上出現(xiàn)細(xì)微差異，故3 種方法測(cè)得的數(shù)據(jù)較為穩(wěn)定，互相之間具有一定的參考性。

5 結(jié) 語(yǔ)

近年來(lái)，隨著人們的生活水平日漸提高，高品質(zhì)、高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、含功能性添加成分的乳制品越來(lái)越多地受到人們追捧，磷脂作為乳中重要的功能性營(yíng)養(yǎng)素，其檢測(cè)方法也成為了國(guó)內(nèi)外相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。我國(guó)在此方面起步較晚，雖然已有較大進(jìn)步，但是對(duì)于上述各類檢測(cè)手段的研究還不夠深入。本文綜述了近20 年來(lái)國(guó)內(nèi)外針對(duì)乳品中磷脂成分的主流檢測(cè)方法，其中，TLC或?qū)⒅鸩奖黄渌軆x器所取代，MS是目前最精細(xì)的磷脂檢測(cè)手段，但HPLC-ELSD應(yīng)用最為廣泛，如果實(shí)驗(yàn)室條件允許，31P-NMR也可成為一種快速且結(jié)果精確的備選檢測(cè)方法。上述儀器都有其各自的優(yōu)缺點(diǎn)，檢測(cè)人員需對(duì)待測(cè)樣品的特征、設(shè)備的可用性和人員的實(shí)驗(yàn)技能進(jìn)行綜合評(píng)估，因地制宜地選取最佳檢測(cè)方案。

就磷脂提取而言，如何有效地去除雜質(zhì)、提高萃取效率、確保檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性和重復(fù)性仍是目前存在的技術(shù)難點(diǎn)。SPE柱的應(yīng)用能有效且定向地對(duì)檢測(cè)基質(zhì)進(jìn)行除雜，因其填料的多樣性和創(chuàng)新性，SPE小柱在未來(lái)的應(yīng)用或?qū)⒅鸩皆黾?，但檢測(cè)人員仍需考慮SPE柱在使用時(shí)回收率較低的缺點(diǎn)。

就定量方法而言，其未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)應(yīng)根據(jù)需求進(jìn)行劃分：如針對(duì)企業(yè)進(jìn)行相關(guān)產(chǎn)品檢測(cè)，液相色譜-ELSD足以滿足批檢和抽檢的需求；但從科研角度考慮，質(zhì)譜類儀器無(wú)疑擁有更大的優(yōu)勢(shì)，這一點(diǎn)從近5 年磷脂檢測(cè)技術(shù)的發(fā)文趨勢(shì)上可以看出。質(zhì)譜類儀器因其精密性和高通量，現(xiàn)有技術(shù)已能對(duì)磷脂上百種分子種類進(jìn)行定量分析，未來(lái)還能對(duì)更多未知的種類進(jìn)行篩查及鑒別。此外，結(jié)合PCA，科研人員能對(duì)磷脂進(jìn)行指紋圖譜的繪制，這項(xiàng)技術(shù)在食品的真實(shí)性和溯源性鑒定上擁有巨大潛力。從表1匯總的數(shù)據(jù)來(lái)看，各文獻(xiàn)報(bào)道的磷脂含量差異性較大，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)間難以互相作對(duì)比，檢測(cè)人員在參考數(shù)據(jù)時(shí)需對(duì)照所使用的檢測(cè)方法和儀器條件。一點(diǎn)重要的啟示是，新方法在開(kāi)發(fā)時(shí)需經(jīng)過(guò)縝密的方法學(xué)驗(yàn)證，需從精密度、檢出限、定量限、回收率和線性關(guān)系等幾個(gè)維度對(duì)方法進(jìn)行綜合評(píng)估，以得到最接近真實(shí)值、有對(duì)比意義且重復(fù)性好的結(jié)果。