豆腐渣果減輕酒精致小鼠氧化應(yīng)激及炎癥損傷的活性研究

張維明　李立紀(jì)　陶劍　陳得玲　唐世朗

摘要：目的 探討傣藥豆腐渣果樹皮和果實(shí)95%乙醇提取物對(duì)酒精引起的氧化應(yīng)激損傷的抗氧化應(yīng)激及抗炎活性。方法 采用采用56度北京紅星二鍋頭白酒，以0.05mL/10 g.d給KM種小鼠連續(xù)灌胃4周，于模型復(fù)制的第2周開始，動(dòng)物在造模的同時(shí)分別給予豆腐渣果樹皮和果實(shí)95%乙醇提取物，連續(xù)給予3周，末次給藥后，處死動(dòng)物，檢測(cè)動(dòng)物血清中MDA、SOD、TNF-α的含量及腦勻漿中MDA、SOD的含量。結(jié)果 與正常組比較，模型組小鼠給予白酒后第4周即出現(xiàn)血清和腦組織中SOD水平明顯下降（P<0.01），MDA水平明顯升高（P<0.01），血清中炎癥因子TNF-α水平明顯升高（P<0.01）。與模型組相比，給予豆腐渣果樹皮和果實(shí)的醇提取物3周后，均可降低血清中MDA水平和TNF-α水平（P<0.05），并可升高血清和腦中SOD水平（P<0.05）。結(jié)論 豆腐渣果樹皮和果實(shí)的95%乙醇提取物可減輕酒精引起的氧化應(yīng)激損傷及炎癥因子釋放。

關(guān)鍵詞：豆腐渣果;抗氧化;抗炎;活性研究

中圖分類號(hào)：R285.5?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?? 文章編號(hào)：1007-2349（2021）10-0075-04

【Abstract】Objective： To study the anti-oxidative stress and anti-inflammatory activities of the 95% ethanol extracts from the bark and fruit of Helicia erratica Hook in Dai medicine on alcohol-induced oxidative stress damage. Methods： 56% degree of Beijing Hongxing Erguotou Liquor were used to give KM mice intragastrically with 0.05mL/10 god for 4 consecutive weeks. Starting from the second week of model replication， the animals were given the 95% ethanol extracts from the bark and fruit of Helicia erratica Hook for 3 weeks at the same time as the model was created. After the last administration， the animals were sacrificed to detect the contents of MDA， SOD， and TNF-α in the animal serum and the contents of MDA and SOD in the brain homogenate. Results： Compared with the normal group， the SOD level in serum and brain tissue of the model group decreased significantly （P<0.01）， the MDA level increased （P<0.01）， and the serum inflammatory factor TNF-α level in the 4th week after the administration of liquor was significantly increased （P<0.01）. Compared with the model group， after 3 weeks of alcohol extracts from the bark and fruit of Helicia erratica Hook， the levels of MDA and TNF-α in the serum could be reduced （P<0.05）， and the levels of SOD in the serum and brain could be increased （P<0.05）. Conclusion： The 95% ethanol extract from the bark and fruit of Helicia erratica Hook can reduce the oxidative stress damage and the release of inflammatory factors caused by alcohol.

【Key words】Helicia erratica Hook; Antioxidant; Anti-inflammation; Activity Study

酒精中毒性腦?。ˋlcoholic Brain Disease，ABD）是酒精中毒最常見、也是最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，是由于長(zhǎng)時(shí)期大量酗酒引起人體營(yíng)養(yǎng)代謝紊亂，導(dǎo)致中樞神經(jīng)損害的一類疾病。肝臟是酒精代謝的主要器官，因此既往對(duì)酒精造成肝臟損傷的研究較為深入，但近年來的研究表明，過度飲酒可造成腦內(nèi)炎癥甚至是不可逆性腦組織損傷[1]，因此ABD的診治越來越引起人們的關(guān)注。

豆腐渣果（深綠山龍眼，Helicia nilagirica Bedd）為山龍眼科Proteaceae山龍眼屬Helicia植物，分布于云南產(chǎn)于云南西南部和南部（西雙版納、普洱、保山等地），是傣醫(yī)用于解除農(nóng)藥中毒、食用野生菌中毒的常用民族藥。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，豆腐渣果的乙醇提取物具有一定的解酒精中毒作用，并能減輕急性腦損傷動(dòng)物腦組織炎癥反應(yīng)，故推測(cè)豆腐渣果可能對(duì)ABD具有潛在活性，本研究擬探討豆腐渣果不同部位的95%乙醇提取物對(duì)酒精誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥因子釋放的影響，為研究其對(duì)抗ABD的活性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 試劑：紅星二鍋頭（北京紅星股份有限公司，批號(hào)：19212938102）;BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（碧云天公司，批號(hào)：063016161009）;小鼠TNF-α ELISA試劑盒、小鼠SOD、MDA試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20190109）;豆腐果苷（Heli）（東京化成工業(yè)株式會(huì)社，批號(hào)：41VZE-DG）。豆腐渣果果實(shí)95%乙醇提取物（自制，提取率6%，給藥濃度7 mg/mL，相當(dāng)于2.28 g生藥/kg）;豆腐渣果樹皮95%乙醇提取物（自制，提取率8%，給藥濃度9 mg/mL，相當(dāng)于2.28 g生藥/kg）。

儀器：分析天平（XS125A，瑞士普利賽斯）;酶標(biāo)儀（Infinite M200 PRO，瑞士Tecan公司）;低溫高速離心機(jī)（cf16RX，Hitachi Koki公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 昆明種小鼠100只，雌雄各半，體重18～22 g。隨機(jī)分成5個(gè)組，分別為：正常組，模型組，樹皮組，果實(shí)組，Heli組，每小組10只。藥物的干預(yù)方案：正常組和模型組均經(jīng)口給予等體積生理鹽水，藥物經(jīng)口給予相應(yīng)的藥物：樹皮組（2.28 g生藥/kg）、果實(shí)組（2.28 g生藥/kg）、Heli組（40 mg/kg）。除正常組外，其余各組用56度北京紅星二鍋頭白酒，以0.05mL/10 g.d灌胃劑量灌胃1周后，于實(shí)驗(yàn)第2周起，每天上午正常組灌胃生理鹽水，其它各組灌胃給予相應(yīng)受試物，6 h后灌胃白酒，劑量同前，連續(xù)給藥+白酒3周，實(shí)驗(yàn)過程每周稱取小鼠體重并記錄小鼠精神狀態(tài)等一般情況，于第4周時(shí)，末次給酒后1h，所有動(dòng)物過量麻醉后心臟取血，3000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，制備血清，檢測(cè)血清中MDA、SOD、TNF-α含量，處死動(dòng)物，冰上取腦，制備腦勻漿，置-80℃冰箱保存，用于檢測(cè)腦組織MDA、SOD含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x[TX-*3/8]±s）表示。組間比較采用單因素方差分析法，方差齊者采用LSD法檢驗(yàn)，方差不齊者采用Tamhane′s法檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 豆腐渣果不同提取物對(duì)小鼠體重的影響 結(jié)果顯示，給予酒精灌胃4周，模型組動(dòng)物體重明顯降低，與正常組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;給予豆腐渣果樹皮和果實(shí)提取物后，動(dòng)物體重較模型組呈上升趨勢(shì)，實(shí)驗(yàn)第四周時(shí)，樹皮組和果實(shí)組動(dòng)物體重明顯高于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;豆腐渣果的活性成分豆腐果苷在整個(gè)給藥過程均可明顯升高動(dòng)物的體重，與模型組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）詳見表1。

2.2 豆腐渣果不同提取物對(duì)小鼠血清中SOD、MDA水平的影響 結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組血清SOD水平顯著降低（P<0.01）;與模型組相比，給予豆腐渣果的果實(shí)提取物可明顯升高血清中SOD水平（P<0.05），但樹皮提取物作用不明顯;給予豆腐果苷的作用不明顯;與正常組相比，模型組血清中MDA水平明顯升高（P<0.01），與模型組比較，給予豆腐渣果的果實(shí)提取物可明顯降低血清中MDA水平（P<0.05），但樹皮提取物作用不明顯;給予豆腐果苷的作用不明顯。詳見表2。

2.3 豆腐渣果不同提取物對(duì)小鼠腦組織中SOD、MDA水平的影響 結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組腦組織中SOD水平顯著降低（P<0.01）;與模型組相比，給予豆腐渣果的果實(shí)提取物和樹皮提取物均可顯著升高血清中SOD水平（P<0.01或P<0.05），給予豆腐果苷也可明顯升高血清中SOD水平（P<0.05）;與正常組相比，模型組腦組織中MDA水平明顯升高（P<0.01），與模型組比較，給予豆腐渣果的果實(shí)提取物和樹皮提取物均可明顯降低血清中MDA水平（P<0.05）;給予豆腐果苷的作用不明顯。詳見表3。

2.4 豆腐渣果不同提取物對(duì)小鼠血清和腦組織中TNF-α水平的影響 結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組血清和腦組織中TNF-α水平顯著升高（*[KG-*4]*P<0.01）;與模型組相比，給予豆腐渣果的果實(shí)提取物和樹皮提取物均可明顯降低血清和腦組織中TNF-α水平（#P<0.05）;給予豆腐果苷的作用不明顯。詳見表4。

3 討論

慢性酒精中毒性腦病是全球常見疾病，可嚴(yán)重危害人類健康。飲酒是云南少數(shù)民族表達(dá)精神生活需要的重要載體，隨著居民生活水平的逐漸提高，該病的發(fā)病率不斷提高。但長(zhǎng)期過量飲酒不僅是導(dǎo)致肝損傷的主要病因，也是誘發(fā)腦血管疾病及老年癡呆的重要危險(xiǎn)因素。目前治療慢性酒精中毒性腦病的措施包括了戒酒、解毒、病因治療、神經(jīng)保護(hù)和康復(fù)治療等。戒酒是慢性酒精中毒性腦病最重要方法，但由于患者往往難以長(zhǎng)期堅(jiān)持而易造成再次酗酒的發(fā)生，苯二氮類解毒藥物治療對(duì)過度飲酒造成的癲癇發(fā)作、譫妄等癥狀具有顯著療效[2]。隨著對(duì)慢性酒精中毒性腦病研究的深入，不斷發(fā)現(xiàn)，該病不僅臨床表現(xiàn)多樣化，其分子機(jī)制也較為復(fù)雜。給臨床治療慢性酒精中毒性腦病患者帶來巨大的挑戰(zhàn)[3]。

云南少數(shù)民族在長(zhǎng)期與疾病作斗爭(zhēng)的過程中積累了很多行之有效、簡(jiǎn)便廉驗(yàn)的方藥，傣醫(yī)解藥是其中最有代表性方藥之一。豆腐渣果是傣醫(yī)用于解酒毒、菌毒、農(nóng)藥中毒的一種解藥[4]。豆腐渣果為山龍眼科山龍眼屬（Helicia）植物深綠山龍眼（Helicia nilagirica Bedd）的種子，課題組前期研究顯示豆腐渣果的活性成分豆腐果苷具有較強(qiáng)的抗血栓形成及降低腦組織炎癥因子TNF-α和IL-1β釋放的作用，在對(duì)豆腐渣果的醇提物進(jìn)行解酒作用初步研究時(shí)發(fā)現(xiàn)其具有一定的解酒作用，故推測(cè)豆腐渣果可能對(duì)慢性酒精中毒性腦病有潛在的活性。為證實(shí)此假說，進(jìn)行了本實(shí)驗(yàn)的研究。

本實(shí)驗(yàn)以豆腐渣果的果實(shí)及樹皮95%乙醇提取物作為研究對(duì)象，考察了它們對(duì)小鼠長(zhǎng)期灌胃白酒后血清和腦組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)和炎癥因子釋放的影響，同時(shí)為了明確豆腐渣果提取物的作用是否為其已知的活性成分豆腐果苷發(fā)揮，故同時(shí)對(duì)豆腐果苷的作用進(jìn)行了考察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，小鼠灌胃56度的食用白酒4周后，體重明顯減輕，血清和腦組織中抗氧化因子SOD明顯降低，氧化應(yīng)激產(chǎn)物MDA水平顯著升高，提示，長(zhǎng)期飲酒引起了機(jī)體明顯的氧化應(yīng)激損傷，同時(shí)，小鼠血清和腦組織中炎癥因子TNF-α釋放增加，表明長(zhǎng)期飲酒引起了機(jī)體炎癥反應(yīng)，同時(shí)也提示，長(zhǎng)期飲酒造成的損傷可涉及多種病理環(huán)節(jié)。給予豆腐渣果的果實(shí)及樹皮95%乙醇提取物后，可明顯升高血清和腦組織中SOD水平，降低MDA水平，說明豆腐渣果的兩種提取物均具有抗氧化應(yīng)激活性;另外，給予豆腐渣果的果實(shí)及樹皮95%乙醇提取物后，小鼠血清和腦組織中的炎癥因子TNF-α釋放減少，說明兩種提取物具有減輕酒精引起的炎癥反應(yīng)。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果還提示，豆腐渣果的果實(shí)及樹皮95%乙醇提取物具有一定的阻止因過度飲酒造成的體重減輕。對(duì)豆腐渣果的已知活性成分豆腐果苷的研究結(jié)果提示，豆腐果苷可以阻止因過度飲酒造成的體重減輕，但對(duì)過度飲酒造成氧化應(yīng)激損傷及炎癥反應(yīng)無明顯的抑制作用。說明豆腐渣果的上述活性并非由豆腐果苷發(fā)揮，其活性成分另有它物。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果為后期解析豆腐渣果作為傣醫(yī)解藥解“酒毒”的物質(zhì)基礎(chǔ)及進(jìn)行作用機(jī)制研究奠定了良好的基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Obad A，Peeran A，Little JI，et al.Alcohol-Mediated Organ Damages[J].Heart and Brain，2018（9）：81.

[2]李藝，彭英.《慢性酒精中毒性腦病診治中國(guó)專家共識(shí)》解讀[J].中國(guó)現(xiàn)代神經(jīng)疾病雜志，2019，19（1）：1-4.

[3]曾玉娥，吳曉牧，楊海玉.慢性酒精中毒性腦病的臨床與病理機(jī)制研究進(jìn)展[J].中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2013，30（5）：475-477.

[4]彭朝忠，段立勝，李學(xué)蘭.傣族民間解毒藥物收集[J].中國(guó)民族醫(yī)藥雜志，2005，2：16-16.

（收稿日期：2021-07-16）