歐芹根總黃酮對體外脂肪肝細(xì)胞模型脂聯(lián)素及其受體表達(dá)的影響

劉 飛，陳 妍，姜 林

（1新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)部，烏魯木齊 830000；2新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥學(xué)部，烏魯木齊 830061）

非酒精性脂肪肝（NAFLD）是臨床常見疾病，主要包括肝脂肪變性以及脂肪異常積蓄，是無明顯飲酒史及既往肝病史的臨床代謝綜合征[1-2]?；颊甙l(fā)生NAFLD 后肝臟會逐步呈硬化狀態(tài)，致使患者進(jìn)一步發(fā)生肝硬化、肝癌等疾病，嚴(yán)重威脅患者生命安全[3]。目前，該病的發(fā)病率逐年上升，且患病人群趨于年輕化。目前NAFLD 防治主要利用藥物進(jìn)行干預(yù)，但他丁類調(diào)脂藥可導(dǎo)致肝臟功能損害[4]。因此尋找副作用小、安全穩(wěn)定的天然藥物對NAFLD 的治療具有臨床意義。課題組前期發(fā)現(xiàn)歐芹根總黃酮能顯著改善NAFLD 大鼠的病理學(xué)改變，且能提升脂聯(lián)素水平[5-8]。脂聯(lián)素(adiponectin，Adipo Q)是由脂肪組織分泌的一種細(xì)胞因子，也稱為30kDa 的脂肪細(xì)胞補(bǔ)體相關(guān) 蛋 白、AdipoQ、apM1 或rGBP28[9]。脂聯(lián)素水平改變預(yù)示著肝臟脂肪變性程度的變化，其水平的降低可形成促炎環(huán)境，在脂肪肝發(fā)展到NAFLD 炎，甚至肝纖維化的過程中起著重要作用[10]。為了探討歐芹根總黃酮治療NAFLD 的作用機(jī)制以及對脂聯(lián)素及其受體的相關(guān)性，進(jìn)行了本實(shí)驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑L-02 人正常肝細(xì)胞購于北納生物，細(xì)胞培養(yǎng)條件為DMEM(高糖)培養(yǎng)基+10%FBS+1%PS，37℃，5% CO2，飽和濕度。歐芹根總黃酮：歐芹根用70% 的乙醇回流提取2 次，每次1 h。提取液濃縮干燥為浸膏。蒸餾水溶解后上樣（D101 型大孔樹脂），依次用30%、50%、70%、90% 的乙醇洗脫，洗脫液濃縮干燥備用。歐芹根總黃酮儲備液：用DMSO 配置為100 mg/mL 的母液，使用時(shí)稀釋至所需濃度。游離脂肪酸（FFA）儲備液：FFA 為油酸OA∶棕櫚酸PA = 2∶1（OA∶PA = 2∶1）。CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱：上海力康儀器有限公司Smart Cell HF-90；酶標(biāo)儀：Bio-Rad公司xMarkTM；凝膠成像系統(tǒng)：上海天能2500；PCR儀：美國Bio-Rad MyCycler Thermal Cycler；Real Time PCR instrument：美國ABI QuantStudio?6 Flex Real-Time PCR Syste。 胎 牛 血 清(FBS)（FND500，Excell Bio）；MEM（高糖）培養(yǎng)基（C11995599BT，GIBCO）；甘油三酯（TG）測定試劑盒（A110-1，南京建成）；總膽固醇（T-CHO）測定試劑盒（A111-1，南京建成）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞模型的建立 與干預(yù)濃度篩選 取匯合率達(dá)90% 的細(xì)胞，胰酶消化細(xì)胞后，制備成5×104個(gè)/mL單細(xì)胞懸液，接種至96 孔板中，37℃、5% CO2培養(yǎng)24 h 貼壁后，棄去培養(yǎng)基，分別加100 μL 不同濃度FFA溶液（0、0.5、1、1.5、2 mmol/L），5 個(gè)重復(fù)，干預(yù)后棄去培養(yǎng)基，加100 μL，10% CCK-8 溶液，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育，1 h 后測定450 nm 處的OD 值。單細(xì)胞懸液，接種至24孔板中，4%的甲醛固定液500 μL固定細(xì)胞20 min；加油紅O 染液,置倒顯微鏡下觀察結(jié)果，觀測細(xì)胞內(nèi)脂滴形成。篩選FFA 無毒性干預(yù)濃度。同法加100 μL 不同濃度歐芹根總黃酮溶液（0、5、10、25、50、100、200 μg/mL）干預(yù)24 h，5 個(gè)重復(fù)，1 h 后測定450 nm處的OD值。篩選出的3個(gè)干預(yù)濃度與FFA共同干預(yù)24 h，收集上清，按MDA 試劑盒進(jìn)行檢測；收集1×106個(gè)細(xì)胞，加入0.2 mLPBS 重懸細(xì)胞，破碎細(xì)胞，放入液氮中5～8 s/次，間隔30 s，制備好的勻漿液不離心，按TG和TC試劑盒進(jìn)行檢測。

1.2.2 歐芹根總黃酮對細(xì)胞模型脂聯(lián)素的影響 按實(shí)驗(yàn)分組干預(yù)細(xì)胞，空白對照組：L-02 細(xì)胞正常培養(yǎng)24 h；NAFLD 模型組：L-02 細(xì)胞FFA 干預(yù)24 h；藥物治療組：L-02 細(xì)胞歐芹根總黃酮+FFA 干預(yù)24 h。收集上清，按MDA 試劑盒說明書進(jìn)行檢測；同時(shí)收集1×106細(xì)胞，加入0. 2 mLPBS重懸細(xì)胞，采用反復(fù)凍融破碎細(xì)胞，放入液氮中5～8 s/次，間隔30 s，制備好的勻漿液不離心按TG、TC 試劑盒說明書進(jìn)行檢測，同時(shí)測定蛋白濃度。棄去每組細(xì)胞瓶中的培養(yǎng)基，加入1 mL Trizol消化細(xì)胞，使Trizol平鋪在細(xì)胞層面上，反復(fù)搖晃細(xì)胞培養(yǎng)瓶，裝入1.5 mL EP 管中。后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)操作，引物信息及PCR 程序詳見表1、2。按實(shí)驗(yàn)分組干預(yù)細(xì)胞，每組3個(gè)重復(fù)，操作方法同細(xì)胞傳代。離心后棄去上清留細(xì)胞沉淀，用5 mL 無菌PBS 洗后收集細(xì)胞。后續(xù)實(shí)驗(yàn)按照Western Blot 實(shí)驗(yàn)操作進(jìn)行，檢測細(xì)胞中ADPN、ADIPOR-2 蛋白表達(dá)。

表1 熒光定量檢測引物信息表

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析運(yùn)用SPSS22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用單因素方差分析方法統(tǒng)計(jì)，所有數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，以P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 熒光定量PCR程序

2 結(jié)果

2.1 FFA 濃度與干預(yù)濃度篩選結(jié)果細(xì)胞增殖檢測及油紅染色結(jié)果顯示FFA 濃度高于1 mmol/L 時(shí)細(xì)胞出現(xiàn)毒性反應(yīng)，故選擇1 mmol/L 進(jìn)行NADLD 模型建立。CCK8 檢測結(jié)果顯示，5～100 μg/mL 濃度對細(xì)胞均無毒性，選擇歐芹根總黃酮濃度為10、25 以及50μg/mL測定生化指標(biāo)，結(jié)果顯示50 μg/mL濃度的歐芹根能明顯降低TG、TC、MDA 水平(P<0.05），結(jié)合油紅O 染色細(xì)胞內(nèi)脂滴形成情況選擇50 μg/mL 歐芹根濃度進(jìn)行干預(yù)，見表3、圖1。

表3 不同濃度歐芹根總黃酮+FFA干預(yù)對L-02細(xì)胞生化指標(biāo)的作用結(jié)果（±s，n=40）

表3 不同濃度歐芹根總黃酮+FFA干預(yù)對L-02細(xì)胞生化指標(biāo)的作用結(jié)果（±s，n=40）

注：與0μg/mL+FFA 1 mmol/L 比較，▲P<0.01；與10 μg/mL+FFA 1 mmol/L 比較，△P<0.05；與25 μg/mL+FFA 1 mmol/L比較，▼P<0.05

歐芹根總黃酮/（μg/mL）FFA 1 mmol/L 0 10 25 50 TG/（mmol/gprot）0.210±0.032 0.203±0.011 0.186±0.019 0.124±0.018▲△▼TC/（mmol/gprot）0.384±0.047 0.378±0.018 0.340±0.044 0.269±0.031▲△▼MDA/ (nmol/mL)2.976±0.649 2.829±0.729 2.634±0.401 1.293±0.372▲△▼

圖1 油紅O染色圖片

2.2 歐芹根總黃酮對細(xì)胞模型的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與空白組相比，ADPN、ADIPOR-2 在NAFLD 模型組中表達(dá)顯著降低；與NAFLD 模型組相比，ADPN、ADIPOR-2在藥物治療組中表達(dá)顯著升高，見表4。

表4 歐芹根總黃酮對NAFLD細(xì)胞模型生化指標(biāo)的作用結(jié)果（±s，n=30）

表4 歐芹根總黃酮對NAFLD細(xì)胞模型生化指標(biāo)的作用結(jié)果（±s，n=30）

注：與空白對照組比較，△P<0.05；與NAFLD 模型組比較，▲P<0.05

分組空白對照組NAFLD模型組藥物治療組TG/（mmol/gprot）0.069±0.010 0.234±0.053△0.159±0.032△▲TG/（mmol/gprot）0.104±0.041 0.320±0.084△0.222±0.031△MDA/ (nmol/mL)1.377±0.385 3.091±0.372△1.792±0.142▲

2.3 qRT-PCR 與WB 檢測結(jié)果與空白組相比，ADPN、ADIPOR-2 在NAFLD 模型組中表達(dá)顯著降低，提示造模成功。與NAFLD 模型組相比，ADPN、ADIPOR-2 在藥物治療組中表達(dá)顯著升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表5、6。

表5 qRT-PCR檢測結(jié)果（±s，n=15）

表5 qRT-PCR檢測結(jié)果（±s，n=15）

注：與空白組相比，△P<0.05;與NAFLD模型組相比，▲P<0.05

分組空白組NAFLD模型組藥物治療組ADIPOR-2 1.006±0.393 0.303±0.162△0.639±0.184▲ADPN 1.019±0.223 0.362±0.161△0.893±0.145▲

表6 WB檢測結(jié)果（±s，n=15）

表6 WB檢測結(jié)果（±s，n=15）

注：與空白組相比，△P<0.05;與NAFLD模型組相比，▲P<0.05

分組空白組NAFLD模型組藥物治療組ADIPOR-2 0.408±0.032 0.216±0.034△0.443±0.045▲ADPN 0.438±0.168 0.230±0.017△0.441±0.026▲

3 結(jié)論

NAFLD 的發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明。但脂質(zhì)代謝紊亂，進(jìn)而引起肝細(xì)胞脂肪變性是NAFLD 的主要特點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，與模型組相比，歐芹根藥物治療組的TC、MDA水平顯著低于模型組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），TG 水平也有所降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。病理切片也表示藥物組肝細(xì)胞變性程度顯著減輕。提示歐芹根總黃酮對NAFLD 有顯著的治療作用。本研究找到了歐芹根總黃酮的最佳細(xì)胞干預(yù)濃度，且發(fā)現(xiàn)治療作用會隨著藥物濃度的升高而增高，提示該藥物的治療作用存在一定的劑量依賴性。

脂聯(lián)素是脂肪細(xì)胞分泌的一種特異性蛋白，以多種形式存在于血漿中，主要通過與脂聯(lián)素受體1(adiponectin receptor 1，Adipo R1) 和脂聯(lián)素受體2(ad?iponectin receptor 2，Adipo R2)2 種受體結(jié)合來發(fā)揮多種生物學(xué)作用，可以通過循環(huán)系統(tǒng)以及旁分泌和自分泌等多種渠道對機(jī)體肝臟、骨骼肌和脂肪組織等脂代謝靶組織產(chǎn)生作用，進(jìn)而達(dá)到調(diào)控機(jī)體脂代謝與維持其平衡的目的[11]。相關(guān)研究認(rèn)為，脂聯(lián)素在NAFLD 的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[12-15]。本研究經(jīng)qRT-PCR 與WB 檢測結(jié)果顯示，與空白組相比，ADPN、ADIPOR-2 在NAFLD 模型組中表達(dá)顯著降低，提示造模成功。與NAFLD 模型組相比，ADPN、ADIPOR-2 在藥物治療組中表達(dá)顯著升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。實(shí)驗(yàn)顯示歐芹根總黃酮能夠明顯提升脂肪肝細(xì)胞的脂聯(lián)素水平和其2 型受體的表達(dá)。提示該藥的作用機(jī)制可能與激活脂聯(lián)素及其相應(yīng)受體相關(guān)。