熱休克蛋白70調(diào)控Bcl-2/Bax對缺氧性肺高壓新生大鼠肺血管內(nèi)皮細胞凋亡及肺動脈壓力的作用

趙 倩，曹 靜，李明霞

（新疆醫(yī)科大學1兒科學院，2第五附屬醫(yī)院新生兒科，烏魯木齊 830011）

新生兒缺氧性肺動脈高壓（hypoxia pulmonary hypertension，HPH）是嚴重威脅新生兒健康的常見急危重癥[1]，發(fā)病機制不清，早期肺血管痙攣病變可逆，到疾病晚期肺血管重塑為不可逆改變，救治困難[2]。該病的起始因素可能是早期的肺血管內(nèi)皮細胞凋亡、損傷，而晚期促凋亡和抑凋亡細胞之間平衡失調(diào)促進了該病的進一步發(fā)展；因此調(diào)控細胞凋亡的相關(guān)蛋白可能參與了該病的發(fā)病機制[3]。熱休克蛋白70（heat shock protein 70，HSP70）是廣泛存在于真核和原核生物中的一種最敏感的應(yīng)激性保護蛋白，其通過促進細胞存活、抑制細胞凋亡參與腫瘤等疾病的發(fā)病過程[4]，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，HPH 新生大鼠肺組織中HSP70 表達升高，降低了肺動脈壓力及肺血管重塑[5]，提示該因子在HPH 疾病中發(fā)揮了重要的保護性作用，然而HSP70 是否通過調(diào)控及如何調(diào)控肺血管內(nèi)皮細胞凋亡，從而參與該保護性機制仍不清楚，需進一步驗證。另有研究表明Bcl-2 和Bax之間表達失調(diào)是HPH 動物模型中肺血管內(nèi)皮細胞凋亡的重要原因，而HSP70 是否作為二者的上游調(diào)控因子參與了這一機制目前不確定[6]。本研究擬在前期研究[5]基礎(chǔ)上通過腺病毒轉(zhuǎn)染提高HPH 新生大鼠肺組織中HSP70 表達，并通過KNK437 抑制肺組織中HSP70 表達，探討其對Bcl-2 和Bax 表達水平的影響及其對HPH 新生大鼠肺血管內(nèi)皮細胞凋亡和肺動脈壓力的影響，為新生兒HPH的治療尋求新的潛在靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑及設(shè)備

1.1.1 實驗動物 128只wistar新生大鼠，體重20～30 g，來自新疆醫(yī)科大學實驗動物中心，實驗動物許可證號：SCXK（新）2011-0004。

1.1.2 試劑及設(shè)備 試劑anti-Bcl-2 (Abcam ab59348)、anti-Bax (Abcam ab53154 ）、anti-HSP70 (Abcamab 2787）；純化的Ad-HSP70-EGFP（Enhanced green flu?orescentprotein，EGFP）（增強型綠色熒光蛋白標記的HSP70 腺病毒轉(zhuǎn)染液）、Ad-CON-EGFP（增強型綠色熒光蛋白標記的空腺病毒轉(zhuǎn)染液）及KNK437（上海西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司）主要設(shè)備有小動物呼吸機( HX-200 型，成都泰盟科技有限公司)、YMS-51 氧濃度控制系統(tǒng)（上海玉研科學儀器有限公司）、透射電子顯微鏡(JEOL-1230 型，日立，日本)、BP-6八導(dǎo)無創(chuàng)血壓監(jiān)測系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)、熒光共聚焦顯微鏡(Leica公司，德國)。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組及目的病毒轉(zhuǎn)染目標基因 將Wistar新生大鼠128只按隨機數(shù)字表分為對照組和缺氧組，缺氧組造HPH 模型，按干預(yù)方法分為HPH 組、HSP70+HPH 組和KNK437+HSP70+HPH 組(KNK437為HSP70 高效抑制劑)。每組分為3、7、10 、14 d 觀察點，每個觀察時間點均為8 只新生大鼠。將HSP70+HPH 組和KNK437+HSP70+HPH 組新生大鼠經(jīng)口氣管插管注入Ad-HSP70-EGFP，注射劑量2 uL×108PFU/只，HPH 組和對照組經(jīng)口氣管插管注入同等病毒滴度的Ad- CON-EGFP，每日KNK437+ HSP70+HPH組腹腔注射KNK437，注射劑量30 μg/只。

1.2.2 建立新生大鼠HPH 模型 各組預(yù)處理后，向低氧艙內(nèi)沖入均勻的氮氧混合氣，通過通氣孔維持低氧艙內(nèi)外壓力平衡，并持續(xù)檢測低氧艙內(nèi)氧濃度、濕度和溫度，維持氧濃度在(10±0.5)%, 濕度60%～70%，溫度22℃～25℃，同時使用鈉石灰和無水氯化鈣分別吸收二氧化碳和水，低氧艙內(nèi)母鼠自由飲水與進食。對照組氧濃度為21%，余同HPH組。

1.2.3 測定平均RVSP 按照不同觀察時間點將新生大鼠常規(guī)麻醉、固定、備皮、消毒、氣管插管，行機械通氣（小動物呼吸機參數(shù)設(shè)置為呼吸頻率100～110次/min、潮氣量4～6 mL/min，監(jiān)測實驗新生大鼠尾部血氧飽和度，使其維持在85%～95%）。作胸骨前U 型切口，打開胸腔，充分暴露心臟，在右心室心尖部用靜脈穿刺置管針刺入，針頭另一端接壓力傳感器，通過八導(dǎo)無創(chuàng)血壓檢測系統(tǒng)記錄平均右心室收縮壓（RVSP），測壓后立即處死大鼠，留取肺組織標本以備后續(xù)實驗。

1.2.4 熒光顯微鏡觀察各組內(nèi)攜帶HSP70 腺病毒的定位部位 各組各觀察時間點新生大鼠處死后立即留取3 mm× 3 mm× 3 mm 的肺中葉肺組織，PBS 清洗，4%多聚甲醛液固定4 h，PBS沖洗3～4次，蔗糖溶液浸泡過夜，OTC包埋，冰凍切片機切為厚度約為6 μm 的冰凍切片，熒光顯微鏡下避光觀察腺病毒攜帶的綠色熒光表達情況。

1.2.5 透射電鏡觀察肺血管內(nèi)皮細胞凋亡變化 各組不同觀察時間點新生大鼠測定平均RVSP 后，立即處死，迅速留取大小約1 mm× 1 mm× 1 mm 肺組織放入4℃2.5% 戊二醛溶液固定2 h，常規(guī)鉛軸電子染色、包埋、切片，厚度小于100 μm。使用透射電子顯微鏡觀察新生大鼠肺血管內(nèi)皮細胞凋亡變化。

1.2.6 免疫組化評價新生大鼠肺組織內(nèi)HSP70、Bcl-2 和Bax 表達情況 各觀察時間點新生大鼠處死后，留取肺組織標本甲醛固定1 w，制作石蠟切片。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，熱抗原修復(fù)。一抗孵育過夜，二抗孵育，二氨基聯(lián)苯胺( DAB ) 顯色，光學顯微鏡采圖。 利用Image-Pro Plus 軟件檢測平均光密度值（IOD/Area）評價蛋白表達情況。

1.3 統(tǒng)計學處理采用SPSS 26.0 軟件包進行數(shù)據(jù)分析。實驗數(shù)據(jù)計量資料描述以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA）檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組新生大鼠平均RVSP 變化HPH 組在缺氧3 d 即可觀察到平均RVSP 明顯增高，隨缺氧時間延長，各觀察時間點均高于對照組（P<0.05），提示HPH新生大鼠模型構(gòu)建成功；缺氧3、7、10 d，HSP70+HPH組平均RVSP 低于HPH 組和KNK437+HSP70+HPH組（P<0.05），與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），缺氧14 d各實驗組平均RVSP對比差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），但均高于對照組（P<0.05）。見表1。

表1 各組新生大鼠平均RVSP變化及單因素方差分析結(jié)果（±s，mmHg）

表1 各組新生大鼠平均RVSP變化及單因素方差分析結(jié)果（±s，mmHg）

注：與對照組比較，aP<0.05;與HPH組比較，bP<0.05;與HSP70+HPH組比較，cP<0.05

組別對照組HPH組HSP70+HPH組KNK437+HSP70+HPH組Fp n 8 8 8 8 3 d 17.54±0.43 21.84±0.66a 17.50±0.41b 21.67±0.73ac 109.38<0.001 7 d 18.35±0.41 24.24±0.39a 18.27±0.36b 23.86±0.24ac 519.59<0.001 10 d 19.80±0.40 26.12±0.37a 20.15±0.28b 25.70±0.72ac 315.90<0.001 14 d 21.37±0.38 28.31±0.54a 27.29±2.17a 28.52±0.42a 51.44<0.001

2.2 攜帶HSP70 腺病毒在新生大鼠肺組織中的定位及免疫組化評估HSP70 表達情況缺氧3、7、10 d各組綠色熒光隨時間延長而逐漸減弱，綠色熒光位于細支氣管周圍，缺氧14 d 各組均未見明顯熒光。見圖1。缺氧3、7、10 d HPH 組新生大鼠肺組織中HSP70表達高于同日齡對照組（P<0.05），缺氧14 d差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05）；缺氧3、7 d HSP70+HPH組HSP70 表達高于HPH 組（P<0.05），缺氧10、14 d 高于HPH組，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05），各觀察時間點均高于對照組（P<0.05）；缺氧3、7、14 d KNK437+HSP70+HPH組HS表達均低于HPH組（P<0.05），各觀察時間點均低于HSP70+HPH 組（P<0.05），較對照組差異無統(tǒng)計學意義。見圖2、表2。

表2 各組新生大鼠肺組織HSP70-IOD/Area及單因素方差分析結(jié)果

圖1 熒光共聚焦顯微鏡下觀察HSP70+HPH組新生大鼠肺組織中的綠色熒光（×200）

圖2 各組新生大鼠肺組織中HSP70免疫組化染色（×200）

2.3 透射電鏡下觀察肺組織內(nèi)皮細胞凋亡變化對照組肺組織內(nèi)皮細胞扁平、形狀規(guī)則，細胞核、染色體形態(tài)和分布均正常，未見凋亡改變；HPH 組缺氧3 d 可觀察到內(nèi)皮細胞發(fā)生凋亡形態(tài)，細胞體積小，質(zhì)著色深，少數(shù)染色質(zhì)濃縮、邊移，缺氧7、10 d 染色質(zhì)呈境界分明的半月狀、塊狀或完全凝聚附于核模，但缺氧14 d 凋亡減少，以膠原纖維增生為主；HSP70+HPH 組在缺氧3 d 時肺血管內(nèi)皮細胞的細胞核形態(tài)和細胞質(zhì)分布比較正常，缺氧7、10、14 d 肺血管內(nèi)皮細胞的細胞質(zhì)發(fā)生變移、凝聚等凋亡和增生變化，其凋亡和增生程度均低于同日齡HPH 組；KNK437+HSP70+HPH組缺氧3 d可觀察到染色質(zhì)濃縮，隨著缺氧時間延長，逐漸觀察到凋亡減少和增生出現(xiàn)，其程度高于同日齡HSP70+HPH 組，較同日齡HPH 組無明顯變化。見圖3。

圖3 HPH新生大鼠缺氧3d肺血管內(nèi)皮細胞凋亡變化（×40 000）

2.4 免疫組化評估Bcl-2 和Bax 表達情況HPH 組缺氧3 d Bcl-2 表達低于對照組（P<0.05），缺氧7、10、14 d 差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05）。HSP70+HPH 組在各觀察時間點Bcl-2 表達均高于HPH 組（P<0.05）；KNK437+HSP70+HPH 組Bcl-2 表達缺氧3、7、10 d 低于HSP70+HPH 組（P<0.05），高于HPH 組但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05）。見圖4、表3。

表3 各組新生大鼠肺組織Bcl-2-IOD/Area及單因素方差分析結(jié)果

圖4 各組新生大鼠肺組織中Bcl-2免疫組化染色（×200）

HPH 組缺氧3、7 d Bax 表達高于對照組（P<0.05），缺氧10、14 d 差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05）。 HSP70+HPH 組缺氧3 d Bax 表達低于HPH 組（P<0.05），缺氧7 d 高于HPH 組（P<0.05），缺氧10、14 d 差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05）；KNK437+HSP70+HPH 組缺氧3 d Bax 表達高于HSP70+HPH 組（P<0.05），缺氧7 d 低于HSP70+HPH 組（P<0.05），缺氧10、14 d差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05），各觀察時間點與HPH組差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05）。見圖5、表4。

表4 各組新生大鼠肺組織Bax-IOD/Area及單因素方差分析結(jié)果

圖5 各組新生大鼠肺組織中Bax免疫組化染色（×200）

3 討論

新生兒HPH 發(fā)病率逐年增多，病死率高[7]，是威脅新生兒健康的重要疾病之一，目前尚缺乏切實有效阻斷疾病進程的治療手段[8-9]。已有研究證實，肺血管內(nèi)皮細胞凋亡在成人HPH 的早期發(fā)生和后期進展中起著關(guān)鍵的作用[10]。 有研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞HSP70 調(diào)控Bcl-2 和Bax 并參與了腫瘤細胞凋亡過程[15]。本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)氣管途徑注入Ad-HSP70-EGFP轉(zhuǎn)染液，提高了新生大鼠肺組織中HSP70 的表達，在缺氧早期促進了Bcl-2表達、抑制了Bax表達，抑制肺血管內(nèi)皮細胞凋亡，降低了肺動脈壓力。

經(jīng)典轉(zhuǎn)染腺病毒的途徑是經(jīng)尾靜脈注射，但本實驗中新生大鼠日齡和體重小，故經(jīng)尾靜脈穿刺難度大，成功率低，影響實驗的順利進行；結(jié)合氣管插管在新生兒窒息復(fù)蘇中迅速有效的應(yīng)用，本研究采用經(jīng)口氣管插管途徑將Ad-HSP70-EGFP 和Ad-CON-EGFP 經(jīng)口氣管內(nèi)注入新生大鼠肺組織，熒光顯微鏡下觀察EGFP 綠色熒光定位于細支氣管周圍處，繼續(xù)觀察發(fā)現(xiàn)隨時間延長腺病毒綠色熒光逐漸減弱，于缺氧14 d 幾乎觀察不到綠色熒光；同時免疫組織化學結(jié)果顯示，缺氧3、7 d，HSP70+HPH 組新生大鼠肺組織HSP70表達水平高于HPH組，但缺氧10、14 d兩組間HSP70的表達水平差異不顯著，說明經(jīng)口氣管插管能夠?qū)y帶HSP70 的腺病毒成功轉(zhuǎn)染至新大鼠肺組織，使HSP70 在新生大鼠肺組織中高表達，但隨著時間延長腺病毒有衰減趨勢，肺組織內(nèi)HSP70水平也降低，考慮其原因可能是：腺病毒載體轉(zhuǎn)染細胞是瞬時的，外源插入的基因片段只能轉(zhuǎn)錄卻無法復(fù)制，不會由于細胞增殖而擴增，且HSP70mRNA 在細胞中半衰期短，易降解，從而導(dǎo)致外源引入的HSP70 絕對高表達無法實現(xiàn)。此外，HPH 組HSP70表達高于對照組，低于HSP70+HPH 組，說明缺氧激活少量內(nèi)源性HSP70 表達，是機體抵抗缺氧應(yīng)激刺激的保護機制之一。

本研究發(fā)現(xiàn)各觀察時間點HPH 組平均RVSP 均高于對照組，表明新生大鼠HPH 模型構(gòu)建成功。通過電鏡觀察肺血管內(nèi)皮細胞發(fā)現(xiàn)，HPH 組缺氧3 d 即可觀察到細胞凋亡變化，缺氧7d、10d 仍存在凋亡改變但程度下降，至缺氧14 d 即可觀察到明顯膠原纖維增生改變，說明在HPH 缺氧早期即發(fā)生肺血管內(nèi)皮細胞凋亡，而隨著缺氧時間延長，凋亡程度降低，而逐漸表現(xiàn)為增殖占據(jù)主導(dǎo)地位，此發(fā)現(xiàn)與成人HPH 中肺血管內(nèi)皮細胞改變相似[10]。本研究發(fā)現(xiàn)隨著缺氧時間延長HSP70 有衰減趨勢，肺血管內(nèi)皮細胞逐漸出現(xiàn)增殖變化，其中缺氧14 d HSP70+HPH 組增殖改變不如HPH 組明顯，考慮腺病毒介導(dǎo)的HSP70 可在缺氧早期通過減少肺血管內(nèi)皮細胞的凋亡發(fā)揮保護作用，從而保護后期肺血管內(nèi)皮細胞表型損傷。同時研究發(fā)現(xiàn)HSP70 能夠降低肺動脈壓力，這與前期課題組發(fā)現(xiàn)一致[11]，但HSP70 隨著腺病毒衰減表達降低，其平均RVSP 仍低于同日齡HPH組，提示HSP70 通過早期抑制肺血管內(nèi)皮細胞的凋亡發(fā)揮降低肺動脈壓力的保護作用。

Bcl-2家族中的Bcl-2、Bax 基因是目前已知的細胞凋亡中最重要的調(diào)控基因，Bax 促進細胞凋亡，Bcl-2 抑制細胞凋亡，兩者的失衡誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡[12]。本研究發(fā)現(xiàn)HPH 組缺氧3 d Bcl-2 表達下降，缺氧3、7 d Bax 表達升高，結(jié)合電鏡下缺氧3 d觀察到凋亡改變，說明在缺氧早期抑凋亡蛋白Bcl-2 下降和凋亡蛋白Bax 升高促進了新生大鼠HPH 肺血管內(nèi)皮細胞的凋亡，肺血管內(nèi)皮細胞受到缺氧刺激，HSP70表達迅速升高，細胞受損嚴重超過HSP70 保護能力，細胞凋亡增加。而HSP70+HPH 組觀察到Bcl-2 表達升高，缺氧3 d Bax 表達下降，HSP70 抑制劑組與HSP70組表達相反，證實腺病毒介導(dǎo)的HSP70可促進Bcl-2 表達上升、抑制Bax 表達下降，同時HSP70+HPH 組可降低肺動脈壓力和延遲凋亡的發(fā)生，提示新生大鼠HPH 缺氧早期腺病毒介導(dǎo)HSP70可通過上調(diào)Bcl-2、下調(diào)Bax 表達，使內(nèi)皮細胞凋亡改善，從而降低肺動脈壓力。本研究顯示缺氧后期Bcl-2 和Bax表達均下降，與文獻[13]結(jié)果不一致，考慮Bcl-2 可能也參與晚期增殖的發(fā)生，但在新生大鼠HPH 缺氧后期可能不是影響肺血管內(nèi)皮細胞增殖的主要因子，同時隨著肺血管內(nèi)皮細胞增殖的發(fā)生是否有部分Bcl-2 被消耗，本實驗未闡述清楚，目前課題組正在進行該疾病增殖相關(guān)研究。

綜上，本研究表明，新生大鼠HPH 經(jīng)口氣管插管腺病毒介導(dǎo)HSP70通過上調(diào)Bcl-2和下調(diào)Bax在新生大鼠HPH 缺氧早期減少肺血管內(nèi)皮細胞凋亡發(fā)揮保護作用，從而降低肺動脈壓力，有望成為治療HPH 潛在靶點的作用。