Bax抑制因子1對人妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥胎盤滋養(yǎng)細胞凋亡的影響及其機制*

馮國惠 美麗班·買買提祖農(nóng) 黃 鶯

（新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院產(chǎn)科，烏魯木齊 830000）

妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥（intrahepatic cholestasis of pregnancy，ICP）是一種以全身皮膚瘙癢、肝功能損傷和（或）血清總膽汁酸升高為主要特征的妊娠期特發(fā)性疾病[1]。研究表明，遺傳、免疫及環(huán)境因素等均參與ICP發(fā)生發(fā)展過程[2]，但ICP的具體發(fā)病機制仍不清楚。胎盤是母體與胎兒的物質(zhì)交換器官，而胎盤絨毛膜滋養(yǎng)細胞是胎盤功能的主要執(zhí)行細胞[3]。大量數(shù)據(jù)表明，ICP患者胎盤絨毛組織凋亡相關基因的表達異常增加，進一步的研究顯示高濃度膽汁酸誘導的滋養(yǎng)細胞凋亡率明顯增加[4-7]。Bax抑制因子1（Bax inhibitor-1，BI-1）是新發(fā)現(xiàn)的一種凋亡抑制因子，其主要表達于膜性細胞器（如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等）表面。BI-1在生物進化中高度保守，且廣泛存在于人體肺、前列腺、心、胎盤等器官與組織中[8-9]。研究表明，BI-1可通過線粒體相關的凋亡途徑阻斷細胞凋亡進程[10-11]。?；悄懰幔╰aurocholate acid，TCA）是膽汁酸的?；撬崤悸?lián)物，常被用來作為ICP的體外誘導物[7]。本研究通過檢測BI-1在ICP患者胎盤組織的表達，并應用TCA與人滋養(yǎng)細胞系HTR8建立ICP體外模型，以探究BI-1在ICP中的作用及其相關機制。

1 材料和方法

1.1 標本采集

選取2018年5月至2019年5月新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院產(chǎn)科住院分娩的ICP孕產(chǎn)婦15例為研究對象，設為ICP組，年齡為（27.3±2.6）歲，孕周為（38.1±4.2）周。ICP的診斷按照中華醫(yī)學會婦產(chǎn)科分會2015年制定的ICP診療指南[12]。另取同時期于本院住院分娩的15例正常孕產(chǎn)婦作為對照組，年齡為（28.5±1.7）歲，孕周為（37.5±5.6）周。2組孕婦的年齡、孕周相比差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。所有孕婦均為自然受孕的單胎初產(chǎn)婦，且分娩方式為經(jīng)陰道分娩。ICP組的納入條件符合ICP診斷標準，疾病排除合并原發(fā)性高血壓、肝腎疾病、代謝及內(nèi)分泌疾病等其他妊娠合并癥患者，且孕期未使用避孕藥、免疫調(diào)節(jié)劑及其他激素類藥物。胎盤娩出后立即從臍帶附著處取約1 cm×1 cm×1 cm大小的胎盤組織5～10塊，避開出血點及鈣化梗死灶，用4℃預冷的生理鹽水沖洗數(shù)遍以除去血污，并將其固定于4%的甲醛溶液中以備后續(xù)實驗使用。所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 細胞系及主要試劑

人絨毛滋養(yǎng)細胞系HTR8由新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科惠贈；DMEM-F12（美國Hyclone公司）；TRIzol試劑、Opti-MEM培養(yǎng)基（美國Invitrogen公司）；胎牛血清（FBS）、1%的青鏈霉素（均為100 U/mL）、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒（武漢博士德生物公司）；SYBR Green PCR試劑盒（上?？禐槭兰o公司）；PCR引物（上海生工公司）；免疫組織化學試劑盒（美國Burlingame公司）；JC-1流式線粒體膜電位檢測試劑盒（北京索萊寶生物科技公司）；攜帶過表達BI-1和陰性對照質(zhì)粒的慢病毒載體（LV-BI-1與LV-NC）由上海吉凱基因化學技術有限公司構(gòu)建及檢測；線粒體提取試劑（Qiagen公司）；兔抗Bcl-2、Bax、cleaved-caspase-3、GAPDH單克隆抗體（美國Cell Signaling Technology公司）；兔抗BI-1單克隆抗體（美國Abcam公司）；小鼠抗細胞色素C（Cyt-C）、細胞色素C氧化酶（COX）Ⅳ單克隆抗體（美國Santa Cruz公司）；辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG（美國Pierce公司）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 免疫組織化學顯色

取固定于甲醛溶液中的胎盤組織，石蠟包埋，切片厚度4 μm，采用SP法檢測2組胎盤組織中BI-1的表達。一抗為兔抗BI-1單克隆抗體（1∶100），二抗為HRP標記的山羊抗兔IgG（1∶200），其余操作嚴格按照試劑盒說明書進行。染色結(jié)果按染色強度與染色范圍進行綜合評定，其中染色強度定義為無色、淡黃色、棕黃色、棕褐色，依次評為0～4分；染色范圍定義為0～10%、11%～50%、51%～75%、76%～100%，依次評為1～4分。最后將兩者相加，0～3分為陰性，4分以上為陽性。

1.4 細胞培養(yǎng)、TCA處理及慢病毒感染與分組

①細胞培養(yǎng)：常規(guī)復蘇HTR8細胞后使用含10 % FBS，1 %青鏈霉素的DMEM-F12培養(yǎng)液于37 ℃、5 % CO2培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。②TCA處理：取生長狀態(tài)良好的HTR8細胞，細胞計數(shù)后，以5×105個/孔接種于12孔板中，分別加入2 mL含10、50、100 μmol/L的TCA培 養(yǎng)液刺激細胞，每個濃度設置3個復孔，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后檢測不同處理條件下細胞中BI-1 mRNA及蛋白的表達。③慢病毒感染：感染前24 h，取生長狀態(tài)良好的HTR8細胞，調(diào)整細胞密度至3×105/mL，并接種于24孔板中，用Opti-MEM稀釋慢病毒液，使其感染指數(shù)（multiplicity of infection，MOI）值為20，同時添加1 μg/mL的Polybrene，置于上述條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，更換為10%FBS的DMEM-F12新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，熒光顯微鏡拍照觀察綠色熒光表達情況。用1 μg/mL的嘌呤霉素篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞進行后續(xù)實驗。④細胞分組：將上述慢病毒感染后的HTR8細胞分為3組，陰性對照組（negative control，NC組），即正常培養(yǎng)的HTR8細胞；TCA+LV-NC組，即經(jīng)100 μmol/L TCA處理的感染LV-NC的HTR8細胞；TCA+LV-BI-1組，即經(jīng)100 μmol/L TCA處理的感染LV-BI-1的HTR8細胞。上述各組細胞置于37 ℃、5 % CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，收集細胞，以備后續(xù)實驗使用。

1.5 Annexin V-FITC檢測各組細胞凋亡

取各組HTR8細胞，1 200 r/min離心5 min后收集細胞沉淀，PBS重懸細胞并計數(shù)；取約6×105個細胞，經(jīng)上述方法再次離心后，依次加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液、5 μL的Annexin V-FITC和10 μL的PI染色液，混勻后室溫下避光孵育30 min，隨即上流式細胞儀進行分析。實驗重復3次。

1.6 透射電鏡觀察HTR8細胞線粒體超微結(jié)構(gòu)

取各組HTR8細胞，2.5%戊二醛室溫下固定12 h后，于1%鋨酸中再次固定2 h，梯度乙醇脫水、包埋、切片，加入醋酸鈾和枸櫞酸鉛染色后制成超薄切片，于透射電子顯微鏡下觀察細胞超微結(jié)構(gòu)變化。

1.7 流式JC-1法檢測線粒體膜電位

取各組HTR8細胞，1 200 r/min離心5 min后收集細胞沉淀，PBS重懸后，收集細胞于離心管中，調(diào)整細胞密度至1×106/mL，加入終濃度為10 μg/mL的JC-1染液，充分混勻后，于37℃細胞培養(yǎng)箱中孵育20 min。上述方法離心3次后，上流式細胞儀檢測。實驗重復3次。

1.8 實時熒光定量PCR（RT-PCR）檢測滋養(yǎng)細胞中BI-1 mRNA的表達

采用TRIzol法提取各組HTR8細胞中總RNA，測定濃度與純度后，按照cDNA合成試劑盒說明書方法將各組細胞中的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再按照SYBR Green PCR試劑盒說明書建議的反應時間與溫度進行RT-PCR反應。BI-1上游引物序列為5'-CCTCTTCTGGTGGATGC-3',下游引物序列為5'-GCCTCGCTCTGTTGATGTGA-3'；GAPDH上游引物序列為5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTT G-3'，下游引物序列為5'-AGGGGCCATCCACAG TCTTC-3'。反應條件為：95oC預變性10 min，95oC變性10 s，60oC退火30 s，72℃延伸15 s，共35個循環(huán)周期。應用公式2-??Ct計算各基因相對表達量。實驗重復3次。

1.9 免疫印跡檢測滋養(yǎng)細胞BI-1及凋亡相關蛋白的表達

采用RIPA及PMSF裂解法提取各組HTR8細胞總蛋白，BCA法進行蛋白定量。配制聚丙烯酰胺凝膠，取約50 μg的蛋白進行SDS-PAGE電泳分離待測蛋白，采用濕轉(zhuǎn)法將分離的蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，5%的脫脂奶粉室溫封閉2 h后，分別加入一抗BI-1（1∶500）、Bcl-2（1∶800）、Bax（1∶800）、cleaved caspase-3（1∶1 000）、Cyt-C（1∶800）、GAPDH（1∶2 000）后，4℃搖床孵育過夜。TBST溶液洗滌，加入HRP標記的山羊抗兔或大鼠抗小鼠IgG（1∶5 000），室溫搖床孵育1 h。按照線粒體提取試劑盒說明書方法于冰上提取細胞中的線粒體，再用蛋白質(zhì)提取試劑盒提取線粒體中的總蛋白，其余步驟同上，加入Cyt-C（1∶1 000）、COX Ⅳ（1∶2 000），并以COX Ⅳ為內(nèi)參。最后在載有蛋白條帶的PVDF膜上均勻滴加ECL發(fā)光液后于凝膠成像儀中進行曝光拍照。Image J軟件測定條帶灰度值，以目標蛋白與內(nèi)參GAPDH的比值作為各蛋白相對含量。以上實驗重復3次。

1.10 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 19.0進行統(tǒng)計學分析，GraphPad Prism 5.0進行統(tǒng)計結(jié)果圖的繪制。計量資料以±s表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 BI-1在胎盤組織中的表達

免疫組織化學顯色結(jié)果顯示BI-1蛋白陽性著色為棕黃色。BI-1雖在胎盤組織中表達強度不高，但仍廣泛分布于胎盤絨毛組織中，且其主要定位于滋養(yǎng)細胞的細胞質(zhì)中。染色結(jié)果分析顯示，正常對照組BI-1蛋白的陽性表達率為16.2%，而ICP組胎盤組織BI-1的陽性表達率為7.4%，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）（圖1，見封二）。

圖1 IHC檢測胎盤組織BI-1的表達，標尺=100 μm。

2.2 TCA對滋養(yǎng)細胞BI-1表達的影響

應用不同濃度的TCA（10、50、100 μmol/L）刺激HTR8細胞24 h后，應用RT-PCR及免疫印跡檢測細胞BI-1 mRNA及蛋白的表達。結(jié)果顯示，與正常培養(yǎng)的HTR8細胞相比，隨TCA濃度的增加，BI-1 mRNA及蛋白表達均逐漸降低，其中以高濃度（100 μmol/L）TCA的抑制作用最為顯著（P<0.01）（圖2，見封二）。

圖2 TCA抑制HTR8細胞BI-1的表達。

2.3 感染慢病毒LV-BI-1后滋養(yǎng)細胞BI-1 mRNA的表達

應用熒光顯微鏡觀察慢病毒的感染效率，結(jié)果顯示（3A，見封二），LV-NC組及LV-BI-1組慢病毒成功感染HTR8細胞，效率可達80%以上。RTPCR檢測感染后細胞中BI-1 mRNA的表達，結(jié)果顯示，與未處理的HTR8細胞相比，感染LV-BI-1組細胞BI-1 mRNA表達顯著增加（P<0.05），而感染LV-NC的細胞無明顯變化（P>0.05），提示成功建立了過表達BI-1的滋養(yǎng)細胞系（圖3B，見封二）。

圖3 感染慢病毒LV-BI-1后HTR8細胞BI-1 mRNA表達顯著增加。

2.4 過表達BI-1對TCA誘導的滋養(yǎng)細胞凋亡的影響

應用Annexin V-FITC流式細胞儀檢測TCA對過表達BI-1 HTR8細胞凋亡的影響，結(jié)果顯示，與NC組相比，TCA+LV-NC組和TCA+LV-BI-1組細胞凋亡率均顯著增加（P<0.05），而與TCA+LVNC組相比，LV+BI-1組HTR8細胞凋亡率明顯降低（P<0.05）（圖4，見封二）。

圖4 過表達BI-1抑制TCA誘導的胎盤滋養(yǎng)細胞凋亡。

2.5 過表達BI-1對TCA誘導的滋養(yǎng)細胞線粒體結(jié)構(gòu)的影響

透射電鏡觀察過表達BI-1對TCA誘導的HTR8細胞線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果顯示，NC組線粒體結(jié)構(gòu)完整，外膜光滑、無腫脹，基質(zhì)內(nèi)顆粒（電子致密的無結(jié)構(gòu)顆粒）含量豐富；TCA+LV-NC組HTR8細胞線粒體結(jié)構(gòu)大量破壞，發(fā)生腫脹，線粒體嵴排列紊亂，線粒體膜破損嚴重，基質(zhì)內(nèi)顆粒明顯減少，且能夠見到少量空泡樣變性；TCA+LVBI-1組可見細胞線粒體結(jié)構(gòu)多數(shù)完整，線粒體嵴變短、數(shù)目減少，但線粒體嵴斷裂少見，基質(zhì)內(nèi)顆粒豐富，僅部分線粒體出現(xiàn)腫脹、膜破損現(xiàn)象（圖5）。

圖5 過表達BI-1改善TCA誘導的滋養(yǎng)細胞線粒體損傷，標尺=1 μm

2.6 過表達BI-1對TCA誘導的滋養(yǎng)細胞線粒體膜電位的影響

JC-1流式細胞儀檢測過表達BI-1對TCA誘導的HTR8細胞線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放水平的影響，結(jié)果顯示，與NC組相比，TCA+LV-NC組和TCA+LV-BI-1組細胞的線粒體膜電位均顯著增加（P<0.05），而與TCA+LV-NC組相比，LV+BI-1組HTR8細胞線粒體膜電位顯著增加（P<0.05）（圖6）。

圖6 過表達BI-1對TCA誘導的滋養(yǎng)細胞線粒體膜電位的影響

2.7 過表達BI-1對TCA誘導的滋養(yǎng)細胞Cyt-C及凋亡相關蛋白表達的影響

免疫印跡檢測過表達BI-1對TCA誘導的HTR8細 胞Bcl-2/Bax比 值、Cyt-C及cleaved caspase-3表達的影響，結(jié)果顯示，與NC組相比，TCA+LV-NC組和TCA+LV-BI-1組細胞Bcl-2/Bax比值均顯著降低（P<0.05），而LV+BI-1組明顯高于TCA+LVNC組（P<0.05）；TCA+LV-NC組 和TCA+LV-BI-1組細胞中總Cyt-C的表達均顯著增加（P<0.05），TCA+LV-BI-1組和TCA+LV-NC組差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；TCA+LV-NC組和TCA+LV-BI-1組細胞線粒體的Cyt-C表達均明顯減少（P<0.05），而TCA+LV-BI-1組較TCA+LV-NC組明顯增加（P<0.05）；TCA+LV-NC組和TCA+LV-BI-1組細胞的cleaved caspase-3顯著增加（P<0.05），而TCA+LV-BI-1組較TCA+LV-NC組顯著降低（P<0.05）（圖7）。

圖7 過表達BI-1對TCA誘導的滋養(yǎng)細胞Cyt-C及凋亡相關蛋白表達的影響

3 討論

高濃度的膽汁酸在體內(nèi)和體外均誘導ICP患者胎盤組織的多種病理性變化，如合體滋養(yǎng)細胞結(jié)節(jié)數(shù)量的增加及凋亡基因的表達升高[14]。而最近的研究證實高濃度膽汁酸誘導的胎盤滋養(yǎng)細胞凋亡是引起ICP孕婦及胎兒并發(fā)癥的病理生理機制的核心，其可能與ICP母體中異常增加的膽汁酸誘導滋養(yǎng)細胞過度凋亡，進而破壞胎盤的物質(zhì)交換及屏障功能，從而增加不良妊娠結(jié)局的發(fā)生風險相關[2，7]。細胞凋亡主要有2種途徑，即通過細胞外信號通路激活的細胞內(nèi)凋亡酶誘導的凋亡與線粒體釋放凋亡激活因子誘導的凋亡，其中線粒體途徑凋亡是細胞死亡的主要方式[9]。線粒體不僅是廣泛存在于細胞中的一種重要細胞器，也同樣是細胞內(nèi)死亡信號的重要感受器與放大器，在調(diào)控細胞凋亡過程中處于關鍵地位[15]。在正常生理水平下，線粒體處于穩(wěn)定狀態(tài)，但當其損傷時，可產(chǎn)生大量超氧化物和活性氧，損傷線粒體正常結(jié)構(gòu)及功能[16]。線粒體膜電位是線粒體在轉(zhuǎn)運物質(zhì)時，膜間隙因積累大量質(zhì)子而形成正電荷，但基質(zhì)內(nèi)呈負電位，這種現(xiàn)象導致線粒體內(nèi)膜兩側(cè)形成電位差。當線粒體正常結(jié)構(gòu)受到損傷時，外膜通透性增加，進而導致線粒體膜電位逐漸下降直至消失，故線粒體膜電位下降預示線粒體結(jié)構(gòu)及功能的破壞，如若有害刺激持續(xù)存在，細胞將啟動線粒體凋亡途徑[17]。

BI-1是新發(fā)現(xiàn)的一種凋亡抑制基因，其蛋白產(chǎn)物能夠抑制由Bax、星形孢菌素等引起的凋亡[9]。既往研究顯示，BI-1并非與Bax直接作用，而是與抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL相互結(jié)合，通過改變其表達，調(diào)節(jié)BI-1/Bcl-XL/Bcl-2和Bax比值，調(diào)控細胞凋亡[8]。同時BI-1還能有效抑制Bax/Bax同源二聚體的形成，從而阻礙其誘導的線粒體內(nèi)Cyt-C的釋放，抑制該途徑引起細胞凋亡發(fā)生[18-21]。此外，BI-1/Bcl-2二聚體能夠與線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的主要組成成分，即外膜電壓依賴性離子通道相結(jié)合，從而保護線粒體結(jié)構(gòu)及功能的完整，進而維持線粒體膜電位的穩(wěn)定，發(fā)揮其抗凋亡作用[19]。

本研究首先通過免疫組織化學顯色顯示BI-1在ICP患者胎盤組織中的表達顯著低于正常對照組；體外培養(yǎng)滋養(yǎng)細胞系HTR8細胞顯示，不同濃度的TCA能顯著抑制滋養(yǎng)細胞BI-1 mRNA表達；應用慢病毒成功構(gòu)建過表達BI-1的滋養(yǎng)細胞，流式細胞術檢測證實TCA能夠顯著促進細胞的凋亡，而過表達BI-1能明顯降低細胞的凋亡。為進一步探究BI-1抑制TCA誘導的滋養(yǎng)細胞凋亡機制，應用透射電鏡觀察不同處理組細胞線粒體超微結(jié)構(gòu)的變化，證實過表達BI-1能明顯保護TCA誘導的滋養(yǎng)細胞線粒體損傷，這與BI-1在其他細胞中對不良刺激誘導的線粒體結(jié)構(gòu)損傷的保護作用一致[22]。JC-1流式實驗結(jié)果表明，過表達BI-1能明顯改善TCA誘導的滋養(yǎng)細胞線粒體膜電位降低趨勢。免疫印跡檢測凋亡相關蛋白顯示，過表達BI-1可能是通過改變Bcl-2/Bax比值，抑制線粒體膜電位降低及結(jié)構(gòu)損傷，從而減少細胞Cyt-C的釋放，最終降低凋亡蛋白caspase-3活化而發(fā)揮上述作用。Cyt-C一般存在于線粒體的內(nèi)、外膜間隙之間，生理條件下其不能穿過線粒體外膜到達細胞質(zhì)，而線粒體膜電位的變化及結(jié)構(gòu)損傷時，Cyt-C從線粒體內(nèi)釋放到細胞質(zhì)中，并作為重要的促凋亡因子，在三磷酸脫氧腺苷的協(xié)同作用下與凋亡蛋白酶活化因子-1相互結(jié)合，激活caspase-3，啟動caspase的級聯(lián)反應，最終導致細胞凋亡的發(fā)生。其中caspase-3是細胞凋亡過程中的關鍵執(zhí)行者，它的活化提示凋亡進入不可逆階段[23-24]。

綜上所述，BI-1在ICP患者胎盤組織中顯著低表達，而過表達BI-1能夠有效降低TCA所誘導的滋養(yǎng)細胞凋亡，其可能作用機制是過表達BI-1通過改變Bcl-2/Bax比值，抑制線粒體膜電位降低及結(jié)構(gòu)損傷，減少線粒體Cyt-C的釋放，從而發(fā)揮抗凋亡作用。本研究首次報道了BI-1在ICP中的表達及其相關作用，為研究ICP機制提供了新的見解。然而，上述作用機制可能僅僅是一個方面，有關BI-1在ICP的其他作用及機制，尚需進一步研究探討。