三種動(dòng)物油脂對(duì)大鼠急性胃粘膜損傷的影響

夏蘊(yùn)實(shí)，孫印石，劉 暢，李志滿，姜 輝，王 梓

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130118；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林長(zhǎng)春 130112；3.長(zhǎng)春大學(xué)食品學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130022；4.吉林特研藥業(yè)有限公司，吉林吉林 132109）

胃粘膜是胃的重要生理屏障，胃粘膜損傷是導(dǎo)致多種胃病的主要因素[1]。吸煙、飲酒、壓力及營(yíng)養(yǎng)缺乏，可能會(huì)危害到由刺激和防御因素維持的胃粘膜完整性的平衡，導(dǎo)致發(fā)生胃潰瘍的風(fēng)險(xiǎn)增加[2]?，F(xiàn)如今，對(duì)胃部疾病的治療主要依賴于合成藥物，這些藥物的使用可能會(huì)引起不同程度的副作用，在這種情況下，從自然資源中尋找安全有效的功能性食品是極為必要的[3?4]。

近年來(lái)，對(duì)胃粘膜損傷的飲食預(yù)防控制已取得很大進(jìn)展，一些食物來(lái)源的功能性成分受到了廣泛關(guān)注。其中動(dòng)物油脂中所富含的不飽和脂肪酸，如亞麻酸、亞油酸和油酸等對(duì)胃粘膜損傷均具有一定的保護(hù)作用[5]，如蠶蛹油[6]能緩解鹽酸/乙醇對(duì)胃組織造成的傷害。許常輝等[7]用鴯鹋油給胃潰瘍大鼠連續(xù)灌胃，結(jié)果表明鴯鹋油能夠抑制乙醇致小鼠胃粘膜損傷且明顯促進(jìn)酸性胃潰瘍大鼠胃潰瘍面愈合。鹿油是鹿科動(dòng)物梅花鹿（Cervus nippon）或馬鹿（Cervus elaphus）的脂肪油，也叫鹿脂。鹿油在古籍《唐本草》中記載：“主癰腫死肌，溫中，四肢不隨，風(fēng)頭，通腠理”[8]?！吨袊?guó)醫(yī)學(xué)大辭典》記：“療面皰瘡，頻頻涂之”。民間多傳鹿油對(duì)胃潰瘍有一定的保護(hù)作用，但現(xiàn)如今關(guān)于鹿油的相關(guān)活性卻鮮有報(bào)道。牛油被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)，不僅具有獨(dú)特風(fēng)味，還富含大量維生素、脂肪酸、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分[9?10]。豬油是提取自豬脂肪組織經(jīng)煉制而成的一種動(dòng)物油脂，其風(fēng)味獨(dú)特且資源豐富易得，但食用豬油對(duì)人體的利弊至今仍褒貶不一[11]。本文通過(guò)分析三種動(dòng)物油脂對(duì)大鼠急性胃粘膜損傷的影響，尋求對(duì)急性胃粘膜損傷具有保護(hù)作用且較易獲得的動(dòng)物油脂，為動(dòng)物油脂的研究與開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SD 大鼠 鼠齡7 周左右，體重170～180 g，購(gòu)于遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司，合格證號(hào)：SCXK（遼）2015-0001；鹿油 未經(jīng)加工的新鮮板油，長(zhǎng)春市世鹿鹿業(yè)有限公司；豬油、牛油 未經(jīng)加工的新鮮板油，長(zhǎng)春市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）試劑盒 南京建成生物工程研究所；大鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）試劑盒、大鼠白細(xì)胞介素6（IL-6）試劑盒 上海酶聯(lián)生物科技有限公司；RNA 提取試劑盒 普洛麥格生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒 羅氏公司；無(wú)水乙醇 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；生理鹽水 昆明南疆制藥有限公司；戊巴比妥鈉、10%中性福爾馬林 北京酷來(lái)博科技有限公司。

GZX-9140MBE 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；HH-4A 數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國(guó)華電器有限公司；商用電磁爐 諸城隆澤機(jī)械有限公司；LDZM-40KCS-2 立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；電子數(shù)顯卡尺605 哈爾濱量具刃具集團(tuán)有限責(zé)任公司；Epoch2 酶標(biāo)儀美國(guó)博騰儀器有限公司；EC3 凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)UVP 公司；DYY-8C 電泳儀電源 北京六一儀器廠；C1000 Touch PCR 儀 美國(guó)伯樂(lè)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 油脂的提取 參考文獻(xiàn)方法[12]，取新鮮的鹿、牛、豬板油，去除粘附的毛、皮等雜質(zhì)殘片，沖洗后瀝干水分，切碎成小塊，設(shè)置商用電磁爐溫度為130 ℃，熬煉提油，過(guò)濾油渣，得到鹿油、牛油和豬油。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及模型建立 參考文獻(xiàn)方法[13]，選取健康的SD 雄性大鼠40 只，飼養(yǎng)在溫度為22～25 ℃，相對(duì)濕度45%～65%環(huán)境中，自由飲水、進(jìn)食，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為8 組，每組5 只，即正常組、模型組、低劑量鹿油組、高劑量鹿油組、低劑量牛油組、高劑量牛油組、低劑量豬油組和高劑量豬油組。灌胃劑量依據(jù)人體每日服用劑量12 g/60 kg換算，并根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)選擇對(duì)大鼠甘油三酯、總膽固醇、高、低密度脂蛋白影響較小的劑量，則低劑量為500 mg/kg，高劑量為850 mg/kg。分別在給藥前期（第1 d 給藥前）、中期（第15 d 給藥前）、末期（第30 d給藥前）稱重并記錄。

正常組、模型組分別灌胃生理鹽水；鹿油、牛油、豬油組每天按10 mL/（kg·bw）灌胃1 次，連續(xù)30 d。末次給藥后，斷糧不斷水24 h。除正常組外，灌胃其余各組大鼠無(wú)水乙醇1.0 mL/只，1 h 后麻醉、心臟取血處死，取胃組織并稱重[14?16]。

1.2.3 大鼠胃粘膜形態(tài)學(xué)觀察 大鼠心臟取血處死后，取完整胃組織，結(jié)扎幽門，灌注10%福爾馬林，固定20 min 后沿胃大彎剪開，用生理鹽水沖洗表面胃內(nèi)容物，展開胃粘膜，觀察胃粘膜出血情況。

1.2.4 組織病理學(xué)檢查 觀察結(jié)束后，選取胃粘膜損傷最嚴(yán)重的部位，以10%中性福爾馬林固定、水洗、脫水透明，浸蠟包埋，修整蠟塊，以5 μm 厚度連續(xù)切片，脫蠟至水，經(jīng)H&E 染色后，鏡下觀察大鼠胃組織病理學(xué)變化。

1.2.5 急性損傷指標(biāo)測(cè)定 用游標(biāo)卡尺記錄出血帶長(zhǎng)度、寬度及出血點(diǎn)個(gè)數(shù)，按表1 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算各組大鼠胃粘膜充血面積、損傷積分指數(shù)、損傷發(fā)生率、損傷抑制率，評(píng)價(jià)三種油脂對(duì)急性胃粘膜損傷大鼠的保護(hù)作用[17?18]。

表1 乙醇對(duì)大鼠急性胃粘膜損傷肉眼觀察評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Criteria for visual observation of ethanol in acute gastric mucosal injury in rats

胃粘膜充血面積=出血帶長(zhǎng)度×出血帶寬度；

個(gè)體損傷評(píng)分=出血點(diǎn)個(gè)數(shù)分值+出血帶長(zhǎng)度分值+出血帶寬度分值×2；

損傷積分指數(shù)=某組損傷評(píng)分總和/該組動(dòng)物數(shù)量；

損傷發(fā)生率(%)=某組出現(xiàn)出血、充血的大鼠數(shù)量/該組大鼠數(shù)量×100；

損傷抑制率（%）=（模型組損傷積分?實(shí)驗(yàn)組損傷積分）/模型組損傷積分 × 100

1.2.6 生化指標(biāo)的測(cè)定 各組大鼠取血后，室溫靜止30 min，在4 ℃條件下，以2500 r/min的轉(zhuǎn)速離心20 min，分離得到血清，按照試劑盒說(shuō)明方法測(cè)定大鼠血清中的SOD 活性、MDA 含量、GSH-Px 活力、IL-6 含量和TNF-α含量。

1.2.7 胃組織中EPO 和EPOR mRNA 表達(dá)水平采用Eastep Super 總RNA 提取試劑盒提取胃組織中的總RNA，使用Quick Drop 檢測(cè)RNA 濃度后，用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定完整性。再按照BioRT cDNA 合成試劑盒方法將分離的RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并通過(guò)使用表2 中所述的基因特異性引物進(jìn)行RT-PCR，GAPDHmRNA的表達(dá)水平作為內(nèi)置參數(shù)。最后，利用含有溴化乙錠的瓊脂糖凝膠電泳觀察PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，并以計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)成像進(jìn)行半定量分析。

表2 實(shí)時(shí)定量PCR 反應(yīng)引物序列Table 2 Sequences of primers for RT-PCR amplification

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 三種動(dòng)物油脂對(duì)大鼠體重、胃重量/體質(zhì)量的影響

實(shí)驗(yàn)期間各組大鼠在各個(gè)時(shí)期體重均持續(xù)增長(zhǎng)，與正常組相比無(wú)顯著性差異（P>0.05）。第30 d經(jīng)無(wú)水乙醇刺激胃粘膜后，模型組大鼠胃重量/體質(zhì)量較正常組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。說(shuō)明經(jīng)無(wú)水乙醇刺激后的大鼠胃組織出現(xiàn)出血、水腫，造模成功。鹿油組胃組織重量較模型組明顯降低，水腫各有一定程度減輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01 或P<0.001），結(jié)果見表3。

表3 三種動(dòng)物油脂對(duì)大鼠體重和胃重量/體質(zhì)量的影響（ ）Table 3 Effects of three kinds of animal fats on rat body weight and stomach weight/body weight（）

表3 三種動(dòng)物油脂對(duì)大鼠體重和胃重量/體質(zhì)量的影響（ ）Table 3 Effects of three kinds of animal fats on rat body weight and stomach weight/body weight（）

注：與模型組相比，#表示顯著（P<0.05），##表示高度顯著（P<0.01），###表示極顯著（P<0.001）;與對(duì)照組相比，*表示顯著（P<0.05），**表示高度顯著（P<0.01），***表示極顯著（P<0.001）；表4、圖3、圖4同。

2.2 三種動(dòng)物油脂對(duì)大鼠急性胃粘膜損傷的形態(tài)學(xué)觀察

如圖1 所示，正常組大鼠胃粘膜完整光滑，無(wú)出血帶及出血點(diǎn)；模型組大鼠胃粘膜表面嚴(yán)重充血糜爛，有明顯粗大的出血帶，且顏色較深；鹿油組大鼠胃粘膜局部輕微出血，表面有較細(xì)小出血帶和出血點(diǎn)；牛油組大鼠胃粘膜表面有多條細(xì)長(zhǎng)出血帶，顏色略深；豬油組大鼠胃粘膜表面有多條較寬出血帶，顏色較深。此外，三種油脂處理組對(duì)胃黏膜形態(tài)的保護(hù)呈現(xiàn)出典型的量效關(guān)系，即同模型組比較，隨著劑量升高，無(wú)水乙醇對(duì)大鼠胃黏膜損傷程度減弱。鹿油和牛油能一定程度上減輕乙醇所致急性胃粘膜損傷，且高劑量組效果優(yōu)于低劑量組，豬油則無(wú)明顯效果。

圖1 三種動(dòng)物油脂對(duì)乙醇致大鼠胃黏膜損傷形態(tài)影響Fig.1 Effects of three animal fats on the morphology of gastric mucosa injury induced by ethanol in rats

2.3 三種動(dòng)物油脂對(duì)大鼠急性胃粘膜損傷的組織病理學(xué)影響

選取各組大鼠胃粘膜損傷最嚴(yán)重部位進(jìn)行H&E 染色，結(jié)果如圖2 所示。正常組大鼠胃黏膜細(xì)胞排列緊密、有序，細(xì)胞的藍(lán)紫色較深，胃黏膜整體形態(tài)完整、邊界清晰、明顯；模型組胃黏膜細(xì)胞排列則松散、無(wú)序，且碎片較多，空腔細(xì)胞聚集成片，具有炎性浸潤(rùn)，胃黏膜腫脹；鹿油組和牛油組細(xì)胞排列較為有序，炎性浸潤(rùn)減少。此外，三種油脂處理組對(duì)胃黏膜形態(tài)的保護(hù)呈現(xiàn)劑量依賴性。

圖2 不同組別大鼠胃黏膜H&E 染色（40×）Fig.2 H&E staining pictures of gastric mucosa of rats in different groups（40×）

2.4 三種動(dòng)物油脂對(duì)大鼠急性損傷指標(biāo)的影響

統(tǒng)計(jì)各組胃粘膜充血面積、損傷積分指數(shù)、損傷發(fā)生率及損傷抑制率，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，模型組大鼠胃黏膜充血面積、損傷積分指數(shù)均高于其它各組，出血情況最為嚴(yán)重，造模成功；與模型組相比，鹿油組胃粘膜充血面積、損傷積分指數(shù)均明顯降低，能夠較大程度地緩解大鼠胃粘膜出血情況，具有極顯著差異（P<0.001）；與模型組相比，牛油組胃粘膜充血面積和損傷積分指數(shù)均有降低，有顯著性差異（P<0.05 或P<0.01）；豬油組損傷積分指數(shù)稍有降低，但較模型組相比，無(wú)顯著性差異（P>0.05);鹿油組、牛油組、豬油組的高劑量組胃粘膜充血面積、損傷積分指數(shù)均低于低劑量組，損傷抑制率高于低劑量組。上述結(jié)果表明，鹿油、牛油對(duì)急性胃粘膜均具有不同程度的保護(hù)作用，且呈明顯劑量依賴性，其中鹿油的保護(hù)效果更佳，豬油無(wú)明顯保護(hù)作用。

表4 三種動(dòng)物油脂對(duì)大鼠急性胃粘膜損傷指標(biāo)的影響（ ）Table 4 Effects of three kinds of animal oils on the indexes of acute gastric mucosa injury in rats（）

表4 三種動(dòng)物油脂對(duì)大鼠急性胃粘膜損傷指標(biāo)的影響（ ）Table 4 Effects of three kinds of animal oils on the indexes of acute gastric mucosa injury in rats（）

2.5 三種動(dòng)物油脂對(duì)大鼠血清抗氧化能力的影響

無(wú)水乙醇攝入會(huì)使細(xì)胞抗氧化能力降低，導(dǎo)致氧化應(yīng)激的發(fā)生，進(jìn)而使機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[19]。GSH-Px、SOD 是重要的內(nèi)源性抗氧化酶，能夠反映機(jī)體清除自由基的能力。MDA 是脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物，可反映體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)程度[20?21]。如圖3 所示，與正常組相比，過(guò)量無(wú)水乙醇可降低血清GSH-Px 及SOD 活性，提高M(jìn)DA 水平。鹿油預(yù)處理有效地提高了血清GSH-Px 和SOD 活性，降低了MDA 水平，且呈劑量依賴性；牛油僅能夠提高SOD活性，降低MDA 水平，呈劑量依賴性；豬油組對(duì)以上指標(biāo)影響不顯著(P>0.05)。這些結(jié)果證實(shí)了鹿油和牛油可以減輕過(guò)量乙醇引起的氧化應(yīng)激，提高機(jī)體抗氧化能力，且鹿油組效果優(yōu)于牛油組。

圖3 三種動(dòng)物油脂對(duì)大鼠血清中GSH-Px、SOD活性和MDA 含量的影響Fig.3 Effects of three kinds of animal oils on GSH-Px,SOD activity and MDA content in rat serum

2.6 三種油脂對(duì)大鼠血清中炎癥因子分泌的影響

TNF-α和IL-6 是兩種重要的促炎細(xì)胞因子，與急性胃粘膜損傷的發(fā)生密切相關(guān)[3]。如圖4 所示，乙醇刺激后的模型組大鼠血清中TNF-α和IL-6 水平較正常大鼠明顯升高（P<0.001）。與模型組大鼠相比，鹿油組大鼠血清炎癥細(xì)胞因子顯著下降(P<0.05)，且呈劑量依賴性，牛油組、豬油組無(wú)明顯影響。結(jié)果表明，鹿油預(yù)處理顯著限制了促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，有效抑制了炎癥因子的分泌。

圖4 三種動(dòng)物油脂對(duì)大鼠血清中TNF-α和 IL-6 含量的影響Fig.4 Effects of three animal fats on serum levels of TNF-α and IL-6 in rats

2.7 鹿油對(duì)大鼠胃組織中EPO 和EPOR mRNA 表達(dá)的影響

EPO（促紅細(xì)胞生成素）是由炎癥誘導(dǎo)的內(nèi)源性細(xì)胞保護(hù)和炎癥調(diào)控的分子，一定程度上能夠抑制促炎癥因子的表達(dá)。EPOR（促紅細(xì)胞生成素受體）是靶細(xì)胞膜表面上的促紅細(xì)胞生成素受體，有研究發(fā)現(xiàn)EPOR 在炎癥細(xì)胞表面表達(dá)[22?23]。對(duì)低、高劑量鹿油組進(jìn)行RT-PCR 檢測(cè)胃組織中EPO 和EPOR mRNA的變化情況，如圖5 所示，與正常組大鼠相比，模型組大鼠胃組織中EPO 和EPOR mRNA的表達(dá)均明顯增強(qiáng)；與模型組相比，高、低劑量鹿油組中EPO 和EPOR mRNA 表達(dá)水平明顯降低。說(shuō)明模型組乙醇攝入后，促炎因子大量分泌，導(dǎo)致EPO 和EPOR 水平升高；鹿油預(yù)處理組分泌較少炎癥因子，則EPO 和EPOR 水平較模型組降低。

圖5 鹿油對(duì)大鼠胃組織中EPO和EPOR mRNA 表達(dá)的影響Fig.5 Effects of deer oil on the expression of EPO and EPOR mRNA of stomach tissure in rats

3 結(jié)論

以乙醇致急性胃粘膜損傷模型[24?27]研究三種常見動(dòng)物油脂對(duì)乙醇所致急性胃粘膜損傷的影響。三種油脂中，鹿油能夠通過(guò)提高GSH-Px 活力和SOD 活性、降低體內(nèi)MDA 含量提高機(jī)體抗氧化能力，并減少IL-6 和TNF-α的分泌，提高機(jī)體抗炎能力，EPO 及EPOR 表達(dá)較少，說(shuō)明鹿油抑制了炎癥因子的表達(dá)，進(jìn)而保護(hù)乙醇所致急性胃粘膜損傷；牛油對(duì)急性胃粘膜損傷也具有一定的保護(hù)作用，可通過(guò)升高SOD 活性、降低MDA 含量提升機(jī)體抗氧化能力對(duì)胃粘膜損傷形成一定的保護(hù)作用，低劑量牛油組無(wú)明顯變化；豬油對(duì)急性胃粘膜損傷的影響無(wú)顯著性差異(P>0.05)，僅是一種簡(jiǎn)單的物理性保護(hù)。故三種動(dòng)物油脂對(duì)急性胃粘膜損傷保護(hù)作用依次是：鹿油>牛油>豬油，呈劑量依賴性。

綜上所述，鹿油對(duì)乙醇致胃粘膜損傷具有良好的改善作用，且鹿作為個(gè)體較大的哺乳動(dòng)物，分布較為廣泛，油脂較容易獲取且提取率高，但其作用機(jī)理還需進(jìn)一步明確。本研究為動(dòng)物油脂在食品、保健品、日用品等各個(gè)領(lǐng)域的開發(fā)利用提供理論依據(jù)，具有重要的理論意義和社會(huì)經(jīng)濟(jì)價(jià)值。