動(dòng)脈粥樣硬化兔主動(dòng)脈血管壁機(jī)械敏感性離子通道蛋白Piezo1表達(dá)與血管內(nèi)膜厚度相關(guān)性分析

代紅燕，趙一蔚，任培樂(lè)，聶永梅，2

1 新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院機(jī)能中心實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊830000；2 西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院大血管外科

動(dòng)脈粥樣硬化（AS）是許多心血管疾病的病理基礎(chǔ)，嚴(yán)重威脅人類的身體健康。剪切應(yīng)力改變可使血管內(nèi)膜局部受損并促進(jìn)斑塊形成，被認(rèn)為是與AS發(fā)生及斑塊破裂最為相關(guān)的力學(xué)因素，其對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的影響已成為AS 研究的熱點(diǎn)［1-2］。血管內(nèi)皮細(xì)胞可感受細(xì)胞外環(huán)境中的力學(xué)機(jī)械刺激，通過(guò)機(jī)械敏感性離子通道激活細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，影響細(xì)胞的增殖、分化、遷移及凋亡，對(duì)維持血管正常功能有著重要意義［3］。Piezo是一種新型的機(jī)械敏感性離子通道蛋白，能夠直接感受到膜上的機(jī)械力來(lái)讓離子通過(guò)［4］。有研究發(fā)現(xiàn)，通道蛋白Piezo1 與心血管疾病有關(guān)，其與AS 的發(fā)生發(fā)展機(jī)制是否有直接聯(lián)系尚未闡明［5］。2018年6 月—2021年6 月，本研究通過(guò)建立兔AS 模型，觀察了AS 發(fā)生發(fā)展過(guò)程中主動(dòng)脈弓部血管內(nèi)膜厚度及血管壁中Piezo1 蛋白的表達(dá)水平，并分析兩者的相關(guān)性，以期為AS血管重構(gòu)提供新的思路及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性新西蘭大白兔32 只，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，3～4 月齡，由新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒購(gòu)自新疆寶信生物科技有限公司，兔蛋白抗體Piezo1 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。石蠟切片機(jī)購(gòu)自美國(guó)賽默飛，電熱恒溫水浴鍋購(gòu)自無(wú)錫馬瑞特科技有限公司。

1.2 分組處理與AS模型制作 大白兔適應(yīng)性喂飼1周后隨機(jī)分為對(duì)照組8只、AS模型組24只，分籠飼養(yǎng)，自由飲水。對(duì)照組給予普通飼料喂飼，AS 模型組給予高脂飼料（83.5%基礎(chǔ)飼料+1.5%膽固醇+5%蛋黃粉+10% 豬油）喂飼；每日每只喂飼量為120～140 g，兩組均給予4 mL/kg 生理鹽水灌胃，1次/天，連續(xù)12周。

1.3 主動(dòng)脈血管壁組織獲取 于造模前及造模后4、8、12 周在禁食12 h 后，以空氣栓塞法處死兩組實(shí)驗(yàn)兔各2 只，放于手術(shù)臺(tái)上迅速開(kāi)胸，充分暴露心臟，分離主動(dòng)脈，切取主動(dòng)脈瓣至腹主動(dòng)脈分叉處，剝除結(jié)締組織及脂肪?？v行剖開(kāi)截取的血管，在生理鹽水中漂洗組織上的殘血和附著的脂肪組織；在主動(dòng)脈弓處取0.5 cm 血管壁組織，放入4% 多聚甲醛溶液中保存；脫水包埋，石蠟切片；同一標(biāo)本平行切片3張，厚度均為4 μm，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 血管壁組織形態(tài)觀察 采用HE 染色。取兩組主動(dòng)脈血管壁組織切片烘片20 min 后，加入二甲苯作用20 min，放入梯度乙醇中。入蘇木精液染色5 min，加入1%鹽酸乙醇液分化。分化后轉(zhuǎn)入自來(lái)水中沖洗，將切片置入75%乙醇伊紅液，放入梯度乙醇中脫水。風(fēng)干切片，滴加中性樹(shù)膠于組織上，取清潔蓋玻片覆蓋，顯微鏡下觀察組織形態(tài)。

1.5 血管內(nèi)膜厚度測(cè)量 對(duì)HE 染色后的切片采集圖象，采用OLYSIA 軟件導(dǎo)入標(biāo)尺，測(cè)定主動(dòng)脈血管內(nèi)膜厚度。

1.6 血管壁Piezo1 表達(dá)檢測(cè) 采用ELISA 法。取主動(dòng)脈血管壁組織樣本，加入0.9% 氯化鈉注射液低溫（-3 ℃至-1 ℃）高速（1 250 r/min）勻漿制成10 %～20 %勻漿液，4 ℃下離心（13 500 r/min）25 min，取上清4 ℃存放。使用兔蛋白抗體包被微孔板，制成固相抗體；在包被單抗的微孔板中依次加入血管壁組織勻漿，再與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的蛋白抗體結(jié)合，形成抗體—抗原—酶標(biāo)抗體復(fù)合物；經(jīng)過(guò)徹底洗滌后，加底物TMB 顯色。TMB 在辣根過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)變成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的蛋白呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定光密度（OD）值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算通道蛋白Piezo1表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以± s 表示，組間比較行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析，主動(dòng)脈血管內(nèi)膜厚度和Piezo1 表達(dá)的關(guān)系采用Pearson 相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血管壁組織形態(tài)觀察結(jié)果 對(duì)照組主動(dòng)脈血管壁分層清楚、內(nèi)膜光滑、無(wú)增厚，內(nèi)皮下無(wú)泡沫細(xì)胞沉積，平滑肌細(xì)胞走行良好。AS模型組造模第4、8 周，主動(dòng)脈血管壁呈點(diǎn)狀突起，內(nèi)膜增厚；造模第12 周，主動(dòng)脈血管壁大部分有點(diǎn)狀隆起，可見(jiàn)斑塊沿管腔分布甚至布滿全周，內(nèi)膜增厚，含許多泡沫細(xì)胞及脂質(zhì)沉積，平滑肌細(xì)胞排列不規(guī)則。見(jiàn)OSID碼圖1。

2.2 兩組血管內(nèi)膜厚度、Piezo1 表達(dá)水平比較 與對(duì)照組同時(shí)點(diǎn)比較，AS模型組造模后各時(shí)點(diǎn)血管內(nèi)膜厚度、Piezo1 表達(dá)水平均增加；與造模前比較，AS模型組造模后各時(shí)點(diǎn)血管內(nèi)膜厚度、Piezo1 表達(dá)水平均增加（P<0.05）。見(jiàn)表1。

表1 主動(dòng)脈血管內(nèi)膜厚度、血管壁Piezo1表達(dá)水平比較（±s）

表1 主動(dòng)脈血管內(nèi)膜厚度、血管壁Piezo1表達(dá)水平比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與造模前比較，#P<0.05。

組別對(duì)照組造模前造模4周造模8周造模12周AS模型組造模前造模4周造模8周造模12周n 8 8血管內(nèi)膜厚度（μm）35.75 ± 3.67 37.88 ± 4.01 39.50 ± 4.32 41.37 ± 4.27 38.00 ± 3.32 69.38 ± 6.08*#115.63 ± 9.03*#193.00 ± 5.12*#Piezo1 64.88 ± 5.85 68.00 ± 4.85 70.75 ± 4.87 73.88 ± 4.17 64.00 ± 3.74 104.57 ± 4.27*#162.86 ± 5.22*#227.43 ± 5.75*#

2.3 血管內(nèi)膜厚度與Piezo1 表達(dá)的相關(guān)性 相關(guān)性分析顯示，造模4、8、12 周血管內(nèi)膜厚度與Piezo1含量均呈正相關(guān)（r0.53，P=0.043；r=0.65，P=0.038；r=0.78，P=0.025）。

3 討論

目前，比較公認(rèn)的AS形成機(jī)制是血管內(nèi)皮損傷學(xué)說(shuō)、脂質(zhì)浸潤(rùn)學(xué)說(shuō)和炎癥反應(yīng)學(xué)說(shuō)。內(nèi)皮損傷是多種因素刺激對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞造成損傷，使血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生功能及器質(zhì)性的改變，脂質(zhì)經(jīng)破損的血管內(nèi)皮沉積到血管壁、平滑肌細(xì)胞間，引起平滑肌細(xì)胞增殖。內(nèi)皮功能障礙及血管重構(gòu)（彈性減弱、僵硬度增加、內(nèi)膜増生）是早期AS的主要病理特征，而血管重構(gòu)既是AS 的病理基礎(chǔ)，也是AS 發(fā)生發(fā)展的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。血管重構(gòu)的發(fā)生發(fā)展與多種因素有關(guān)，包括血流動(dòng)力學(xué)的改變，血管活性物質(zhì)的變化等。血管壁作為與血流直接接觸的屏障，可在血液剪切應(yīng)力變化時(shí)，將剪切應(yīng)力對(duì)變化轉(zhuǎn)化成信號(hào)傳遞給鄰近的細(xì)胞，釋放相應(yīng)的血管活性物質(zhì)，從而影響細(xì)胞外基質(zhì)，使血管作出相應(yīng)的改變應(yīng)答。本研究結(jié)果顯示，高脂飼料喂飼實(shí)驗(yàn)兔4、8、12 周，主動(dòng)脈弓部血管壁內(nèi)膜逐漸增厚。建模12周后，主動(dòng)脈斑塊沿管腔分布甚至布滿全周，血管內(nèi)膜含許多泡沫細(xì)胞及脂質(zhì)沉積，主動(dòng)脈弓血管壁發(fā)生結(jié)構(gòu)重構(gòu)，提示AS模型建立成功。

機(jī)械敏感性離子通道蛋白Piezo1是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的內(nèi)皮細(xì)胞膜上對(duì)機(jī)械刺激敏感的感受器之一，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞有重要作用。Piezo1 通道作為陽(yáng)離子通道可以調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物的機(jī)械敏感傳導(dǎo)，其在干細(xì)胞中的過(guò)度表達(dá)能夠產(chǎn)生強(qiáng)烈的非選擇性機(jī)械陽(yáng)離子電流，該作用與Ca2+流動(dòng)相關(guān)［6］。Piezo1蛋白由Piezo1/FAM38A 基因編碼，預(yù)計(jì)由包含了30 個(gè)跨膜區(qū)域的約2 500 個(gè)氨基酸構(gòu)成，參與細(xì)胞發(fā)育、血管容量調(diào)節(jié)、細(xì)胞遷移以及細(xì)胞的增殖和延長(zhǎng)等過(guò)程，通過(guò)阻斷劑GsMTx4 可以抑制其活性［7］。研究顯示，Piezo1在小鼠發(fā)育血管的內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，其基因的缺失在妊娠中期影響血管重構(gòu)，可造成小鼠胚胎發(fā)育的致命性損傷［8］。Piezo1是血管區(qū)域的重要部分，在體外層流剪切應(yīng)力的作用下，Piezo1 的機(jī)械力傳導(dǎo)與細(xì)胞的形態(tài)學(xué)調(diào)節(jié)有關(guān)，血管內(nèi)皮細(xì)胞中Piezo1 的缺失，會(huì)造成細(xì)胞排列缺陷［9］。有研究顯示，運(yùn)動(dòng)過(guò)程中血流可以影響Piezo1 這一機(jī)械通道，最終引起血管的收縮［10］。本研究結(jié)果顯示，隨著造模時(shí)間延長(zhǎng)，AS 模型主動(dòng)脈血管壁中Piezo1 表達(dá)增加，并與血管內(nèi)膜厚度呈正相關(guān)。其原因可能為血液流變剪切應(yīng)力作用激活了血管內(nèi)皮細(xì)胞上的通道蛋白Piezo1，引起血管皮細(xì)胞形態(tài)和功能改變，從而造成血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷及內(nèi)膜增生。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了兔AS 模型，并發(fā)現(xiàn)主動(dòng)脈血管壁通道蛋白Piezo1及血管內(nèi)膜厚度隨著AS 的發(fā)生發(fā)展均有增加。 這提示通道蛋白Piezo1 參與AS 的發(fā)生發(fā)展，該機(jī)制可能與剪切應(yīng)力的變化激活通道蛋白Piezo1，引起血管內(nèi)皮細(xì)胞受損從而導(dǎo)致血管重構(gòu)有關(guān)。