應(yīng)用iTRAQ技術(shù)鑒定糖尿病痛性神經(jīng)病變血清蛋白 標(biāo)志物

田佳佳，李鵬，陳華永

(濰坊市益都中心醫(yī)院，山東 濰坊 262500)

0 引言

糖尿病痛性神經(jīng)病變(Diabetic Peripheral Neuropathy Pain，DPNP)是一種常見的糖尿病周圍神經(jīng)病變并發(fā)癥，在臨床上以痛覺過敏和自發(fā)痛為主要的表現(xiàn)，會(huì)嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。近幾年的研究認(rèn)為，DPNP的發(fā)生是多種細(xì)胞因子、蛋白質(zhì)和信號(hào)傳導(dǎo)通路共同作用的結(jié)果。但是，目前在臨床上針對(duì)DPNP沒有有效的治療手段，非甾體類抗炎止痛藥物和阿片類麻醉藥物只能暫時(shí)的緩解癥狀，并且會(huì)帶來大量的副作用[1]。iTRAQ技術(shù)一種能夠?qū)Χ嘟M樣本同時(shí)進(jìn)行分析的蛋白組學(xué)技術(shù)，結(jié)合液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)已經(jīng)成為蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究的主要工具，廣泛的用于各種生物學(xué)標(biāo)志物的尋找。本實(shí)驗(yàn)旨在利用iTRAQ技術(shù)篩選糖尿病痛性神經(jīng)病變患者血清中發(fā)生差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，聯(lián)合生物信息學(xué)分析差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，從而為進(jìn)一步研究糖尿病痛性神經(jīng)病變的發(fā)病機(jī)制提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀、Nano-Tempo LC點(diǎn)靶儀、iMark型酶標(biāo)儀、Agilent 1200 series液相色譜儀；iTRAQBuffer試劑盒、胰酶、Multiple Affinity Removal System (MARS) Human 14親和層析柱。

1.2 樣本采集及分組

選取2020年3到至2021年3月在濰坊市益都中心醫(yī)院內(nèi)分泌科住院的100例2型糖尿病患者。按照2013年中華醫(yī)學(xué)會(huì)糖尿病學(xué)分會(huì)制定的T2DM診斷標(biāo)準(zhǔn)和2009年美國(guó)糖尿病學(xué)會(huì)共識(shí)聲明中的DPN診斷標(biāo)準(zhǔn)，將2型糖尿病患者分為2組，A組：?jiǎn)渭兲悄虿〗M，50例；B組：糖尿病痛性神經(jīng)病變組，50例。

診斷標(biāo)準(zhǔn)：(1)2013年中華醫(yī)學(xué)會(huì)糖尿病學(xué)分會(huì)制定的T2DM、DPNP；(2)2009年美國(guó)糖尿病學(xué)會(huì)共識(shí)聲明中有關(guān)DPNP的診斷標(biāo)準(zhǔn)。

排除標(biāo)準(zhǔn)：患有糖尿病腎病、糖尿病視網(wǎng)膜病變等微血管病變；患有嚴(yán)重高血壓和心腦血管疾??；感染性疾??；惡性腫瘤；自身免疫性疾?。徽诮邮芸股刂委煹幕颊?；吸煙，飲酒有精神類藥物的濫用病史的患者；妊娠和哺乳期患者；其他原因引起周圍神經(jīng)痛的患者。

血液采集經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并征得患者本人或者家屬的同意，每日清晨空腹抽取靜脈血5mL于促凝管內(nèi)，分別記為糖尿病組和糖尿病痛性神經(jīng)病變組，在室溫中放置30min，使用4℃恒溫離心機(jī)3000r/min離心20min，分離上層血清，放置于-80℃冰箱保存。

1.3 高豐度蛋白的去除

把-80℃冰箱保存的血清在冰上復(fù)溶，各組的50例樣本分別取5μL進(jìn)行等體積的混合，然后應(yīng)用MARS HUMAN-14免疫親和色譜柱去掉在血清中高表達(dá)的白蛋白、IgG、轉(zhuǎn)鐵蛋白等14種蛋白。剩下的低豐度蛋白使用離心濃縮器濃縮，并測(cè)定蛋白的濃度。

1.4 使用胰酶酶解和進(jìn)行標(biāo)記

每一組樣本取100μg蛋白，進(jìn)行變性、還原、半胱氨酸修飾和胰酶酶解等前期處理，然后使用iTRAQ試劑對(duì)糖尿病組和糖尿病痛性神經(jīng)病變組分別進(jìn)行標(biāo)記。

1.5 質(zhì)譜分析

完成標(biāo)記的酶解多肽混合物首先進(jìn)行脫鹽，再使用液相色譜儀進(jìn)行色譜分離，分離完成后使用第二維反相色譜分離并點(diǎn)靶。點(diǎn)靶完成后使用質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析。

1.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析使用ProteinPilot軟件，在人類IPI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行搜索。選擇可信度區(qū)間≧95%或者Protscore≧1.3的蛋白進(jìn)行認(rèn)定，把113為對(duì)照組，比值≧1.5或者≦0.67作為閾值篩選差異蛋白。使用DAVID對(duì)鑒定得到的差異蛋白質(zhì)進(jìn)行功能注釋，其中選擇GO(gene ontology)的生物過程、細(xì)胞成分和分子功能注釋對(duì)蛋白進(jìn)行分類，在KEEG的通路數(shù)據(jù)庫中對(duì)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行分類和通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)譜鑒定結(jié)果

數(shù)據(jù)利用Protein Pilot軟件搜索得到可信度大于95%的蛋白170種，差異表達(dá)的蛋白23種，較糖尿病組表達(dá)上調(diào)的蛋白有16種，下調(diào)的蛋白質(zhì)7種，見表1。

表1 兩組比較，上調(diào)或者下調(diào)差異1.5倍以上的蛋白質(zhì)

2.2 生物學(xué)功能分析

對(duì)糖尿病痛性神經(jīng)病變患者發(fā)生差異表達(dá)的23種蛋白質(zhì)進(jìn)行基因功能聚類分析以及通路的分類和富集分析后發(fā)現(xiàn)這23種蛋白主要參與了炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)、激活補(bǔ)體系統(tǒng)、細(xì)胞凋亡過程、蛋白酶類的水解等生物學(xué)過程；細(xì)胞組分主要包括細(xì)胞膜結(jié)合蛋白、核蛋白復(fù)合體、免疫攻擊復(fù)合物等；分子功能主要為結(jié)合催化功能；富集到的信號(hào)通路主要是多種細(xì)胞因子介導(dǎo)的炎癥信號(hào)通路、凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)等。

3 討論

隨著對(duì)糖尿病痛性神經(jīng)病變研究的進(jìn)一步深入，發(fā)現(xiàn)不論是神經(jīng)的異常放電、神經(jīng)生長(zhǎng)因子的改變或者是神經(jīng)的中樞敏化等作用大都能夠轉(zhuǎn)歸到各種細(xì)胞因子引起的炎癥反應(yīng)上，了解這些細(xì)胞因子的信號(hào)通路和作用對(duì)象對(duì)更加深入的了解和闡釋糖尿病痛性神經(jīng)病變的發(fā)生機(jī)制具有重要的意義。本研究利用itraq技術(shù)對(duì)糖尿病和糖尿病痛性神經(jīng)病變患者的血清進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)了23種差異蛋白。

在本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果中，糖尿病痛性神經(jīng)病變組發(fā)生上調(diào)的蛋白中有3個(gè)為炎癥反應(yīng)蛋白，分別為α1-抗胰蛋白酶、血清淀粉樣蛋白A(SAA)、C反應(yīng)蛋白(CRP)。α1-抗胰蛋白酶主要在肝臟，是一種重要的血清蛋白溶解酶抑制物。Graterol[2]等α1-抗胰蛋白酶能夠通過細(xì)胞內(nèi)途徑活化核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)，而κB(NF-κB)是一種在人體組織細(xì)胞中廣泛存在，在過度炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。C-反應(yīng)蛋白和SAA是敏感的炎癥指標(biāo)。

S100 A8是低分子量鈣結(jié)合蛋白，在抑制細(xì)胞增殖、導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和急性炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用。該蛋白能夠激活單核巨噬細(xì)胞的釋放，在炎癥過程中改變細(xì)微的結(jié)構(gòu)骨架，使白細(xì)胞的變形能力增加，匯聚到微血管處，使炎癥反應(yīng)級(jí)聯(lián)擴(kuò)大而而加重組織的損傷。微血管病變是糖尿病痛性神經(jīng)病變的病理生理學(xué)基礎(chǔ)。近年來，炎癥因子與糖尿病并發(fā)癥之間的關(guān)系也逐漸被認(rèn)識(shí)[3,4]。一項(xiàng)關(guān)于糖尿病周圍神經(jīng)病變的研究表明，隨著糖尿病周圍神經(jīng)病變程度的加重，S100A8/A9的濃度逐漸增加，提示S100A8/A9可能參與DR患者的血管炎癥反應(yīng)，其濃度的變化對(duì)糖尿病痛性神經(jīng)病變的嚴(yán)重程度有預(yù)測(cè)作用[5]。Tabur S等研究發(fā)現(xiàn)糖尿病合并周圍神經(jīng)病變患者體內(nèi)S100A8/A9水平明顯高于正常人及糖尿病未合并神經(jīng)病變組，且S100A8/A9水平與C反應(yīng)蛋白、糖化血紅蛋白呈正相關(guān)[6]。

凝血栓蛋白-1(thrombospondin-1，簡(jiǎn)稱TSP-1)，是一種細(xì)胞外糖蛋白。TSP-1與TGF-β具有非常高的親和性，具有重要的抗炎癥作[7]。Kong P等研究發(fā)現(xiàn),在糖尿病微血管病變患者血清中TSP-1水平會(huì)有明顯的升高，并且與hs C-RP呈正相關(guān)，與MA-IR、HOMA-β水平呈負(fù)相關(guān)，前者是炎性反應(yīng)的非特異性敏感指標(biāo)，后兩者則是糖尿病微血管病變的保護(hù)因素[8]。

本研究利用iTRAQ技術(shù)構(gòu)建了糖尿病患者和糖尿病痛性神經(jīng)病變患者血清的差異表達(dá)蛋白圖譜，為進(jìn)一步的了解糖尿病痛性神經(jīng)病變的發(fā)病機(jī)制，并進(jìn)行早期的干預(yù)和治療提供了重要的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但本實(shí)驗(yàn)僅為初步研究，樣本量相對(duì)較少，所篩選出的一系列差異蛋白尚需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證。