高效液相色譜法同時(shí)測定五蟲化瘀通絡(luò)膠囊中3 種活性成分

榮娟娟 祁 俊 韓曉珂 徐 斌 陳 娟 王 權(quán)

安徽省蕪湖市中醫(yī)醫(yī)院制劑室，安徽蕪湖 241000

五蟲化瘀通絡(luò)膠囊（皖藥制字Z20100005）是安徽省蕪湖市中醫(yī)醫(yī)院（以下簡稱“我院”）專家經(jīng)驗(yàn)方，主要由當(dāng)歸、川芎、丹參、地龍、蜈蚣、全蝎、土鱉蟲、水蛭等多味中藥組成。具有活血化瘀、通絡(luò)止痛的功效，經(jīng)過老中醫(yī)多年的臨床驗(yàn)證，其療效可靠。主要用于治療瘀血阻滯所致的缺血性股骨頭壞死，骨折后疼痛，活動(dòng)不利、骨不愈合等癥[1-8]。原有的高效液相色譜法含量測定標(biāo)準(zhǔn)僅以丹酚酸B 定量控制五蟲化瘀通絡(luò)膠囊的質(zhì)量，測定指標(biāo)較單一。為了更好地進(jìn)行質(zhì)量控制，需要制訂更加合理的含量測定方法，本研究通過高效液相色譜法同時(shí)測定五蟲化瘀通絡(luò)膠囊中阿魏酸、丹酚酸B 和丹參酮ⅡA 3 種指標(biāo)成分[9-10]，用于監(jiān)控五蟲化瘀通絡(luò)膠囊的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀（美國Agilent 公司，型號(hào)：Agi lent 1200 型）；萬分之一電子天平（Mettler 公司，型號(hào)：XP-205）；數(shù)控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司，型號(hào)：KQ-500DB）；數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠，型號(hào)：GZX-9140MBE）。

1.2 試藥

阿魏酸對(duì)照品（批號(hào)：110773-201614，純度99.0%），丹酚酸B 對(duì)照品（批號(hào)：111562-201716，純度94.1%），丹參酮ⅡA 對(duì)照品（批號(hào)：110766-201721，純度99.5%）均購于中國食品藥品檢定研究院；乙腈（TEDIA Company，色譜級(jí)）；甲醇（TEDIA Company，色譜級(jí)）；磷酸（上海展云化工有限公司，色譜級(jí)）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以乙腈（A）-0.1%磷酸（B）為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫（0～8 min，22%A；9～19 min，26%A；20～34 min，80%A；35～40 min，22%A）；柱溫：20℃；流速：1.0 ml/min；檢測波長：0～21 min 為286 nm（檢測阿魏酸和丹酚酸B），21～40 min 為270 nm（檢測丹參酮ⅡA）；進(jìn)樣量10 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取阿魏酸對(duì)照品、丹酚酸B 對(duì)照品和丹參酮ⅡA 對(duì)照品適量，加入甲醇制成濃度分別是10.56、219.06、6.52 μg/ml 的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密吸取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液3 ml，同時(shí)放于10 ml 的容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，制成含阿魏酸3.17 μg/ml、丹酚酸B 65.72 μg/ml 和丹參酮ⅡA 1.96 μg/ml 的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取五蟲化瘀通絡(luò)膠囊（批號(hào)：201110）20 粒，倒出內(nèi)容物，混合，研細(xì)，精密稱量約0.5 g，置于刻度為150 ml 的具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇溶液50 ml，蓋上玻璃塞，用封口膜封緊，稱定其重量，置超聲儀（350 W，40 kHz）中超聲處理30 min，放冷至室溫，稱定其重量，再用75%的甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，即得供試品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 按處方配比稱取除當(dāng)歸、川芎和丹參飲片以外的其他飲片，按照五蟲化瘀通絡(luò)膠囊制備工藝及供試品溶液的制備方法配制成缺味當(dāng)歸、川芎和丹參的陰性樣品溶液。

2.3 方法專屬性考察

精密吸取上述3 種溶液各10 μl，依法測定。結(jié)果顯示阿魏酸、丹酚酸B 和丹參酮ⅡA 與樣品中其他組分的分離度良好，陰性樣品色譜峰在相應(yīng)位置未檢出，其專屬性良好。見圖1。

圖1 五蟲化瘀通絡(luò)膠囊色譜圖

2.4 線性關(guān)系考察

取混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，精密吸取5 ml，同時(shí)放于10 ml 的容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，制成含阿魏酸5.28 μg/ml、丹酚酸B 109.53 μg/ml 和丹參酮ⅡA 3.26 μg/ml 的混合對(duì)照品溶液，各精密吸取1、2、4、6、8、10 μl，分別進(jìn)樣測定，以樣品濃度為橫坐標(biāo)（X），色譜峰的出峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行曲線擬合。得到阿魏酸的回歸方程為Y=44.592X-1.6293，R2=0.9999，表明在0.528～5.280 μg/ml 范圍內(nèi)，阿魏酸對(duì)照品線性關(guān)系良好。得到丹酚酸B 的回歸方程為Y=11.421X+14.434，R2=0.9996，表明在10.953～109.530 μg/ml 范圍內(nèi)，丹酚酸B 對(duì)照品線性關(guān)系良好。得到丹參酮ⅡA 的回歸方程為Y=63.063X-3.8696，R2=0.9994，表明在0.326～3.260 μg/ml 范圍內(nèi)，丹參酮ⅡA 對(duì)照品線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn)

連續(xù)進(jìn)樣上述混合對(duì)照品溶液6 次，每次10 μl，分別記錄阿魏酸、丹酚酸B 和丹參酮ⅡA 的峰面積，計(jì)算得阿魏酸峰面積的RSD 為0.58%，丹酚酸B 峰面積的RSD 為0.64%，丹參酮ⅡA 峰面積的RSD 為0.78%。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批五蟲化瘀通絡(luò)膠囊（批號(hào)：201110），按“2.2.2”項(xiàng)下方法，精密稱定后分別配制成6 份供試品溶液，再精密吸取各10 μl 的混合對(duì)照品溶液和供試品溶液，注入液相色譜儀，分別測定。計(jì)算得阿魏酸含量的RSD 為1.77%；丹酚酸B 含量的RSD 為0.88%；丹參酮ⅡA 含量的RSD 為0.91%。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液，精密吸取10 μl，在配制好后的第0、2、4、6、8、10 h 分別進(jìn)樣1 次，測得峰面積積分值。計(jì)算阿魏酸峰面積的RSD 為0.41%，丹酚酸B 峰面積的RSD 為0.21%，丹參酮ⅡA 峰面積的RSD 為0.38%，結(jié)果顯示供試品溶液測定在10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收試驗(yàn)

采取加樣回收法，取已知含量的五蟲化瘀通絡(luò)膠囊內(nèi)容物（批號(hào)：201110）9 份，每份約0.25 g，精密稱定，分別放于50 ml 的容量瓶中，分別精密加阿魏酸、丹酚酸B 和丹參酮ⅡA 對(duì)照品適量，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測定膠囊含量并計(jì)算加樣回收率。見表1。

表1 阿魏酸、丹酚酸B 和丹參酮ⅡA 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2.9 樣品含量測定

分別精密稱量201110、201119、201126 三批五蟲化瘀通絡(luò)膠囊樣品各約0.5 g，依照五蟲化瘀通絡(luò)膠囊含量測定法進(jìn)行測定，計(jì)算樣品中阿魏酸、丹酚酸B和丹參酮ⅡA 含量。見表2。

表2 三批樣品含量測定結(jié)果（mg/g）

3 討論

五蟲化瘀通絡(luò)膠囊是中藥復(fù)方制劑，由多味中藥組成，療效確切，為了更好地控制院內(nèi)制劑的質(zhì)量，需要對(duì)我院制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行提高和完善。當(dāng)歸、川芎藥材中所含的阿魏酸成分，具有活血行氣、祛風(fēng)止痛的功效，現(xiàn)代藥理顯示其具有抗血小板聚集、緩解血管痙攣等作用[11-14]。丹參的主要藥效成分丹酚酸B，具有活血祛瘀、通經(jīng)活絡(luò)、涼血消腫的功效[15-16]。丹參酮ⅡA 具有保護(hù)血管內(nèi)皮、改善微循環(huán)、抗炎、抗感染等多種藥理作用，可以減輕炎癥反應(yīng)，提高機(jī)體免疫能力[17-18]。故本研究選擇了阿魏酸、丹酚酸B 和丹參酮ⅡA 3 種活性成分進(jìn)行含量測定。

參考相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道及《中華人民共和國藥典》，確定了阿魏酸、丹酚酸B 和丹參酮ⅡA 的最大吸收波長分別為286、321、270 nm，結(jié)合丹參是本制劑品種的君藥成分，故僅選取286、270 nm 作為檢測波長[19-22]。高效液相色譜法測定中藥制劑中的阿魏酸、丹酚酸B 和丹參酮ⅡA 常采用乙腈-磷酸水、乙腈-甲酸水等流動(dòng)相進(jìn)行檢測[23-26]，因此，本研究考察了乙腈、磷酸水、甲酸水幾個(gè)不同組合，經(jīng)過比對(duì)選取乙腈-0.1%磷酸作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。

本研究通過高效液相色譜法同時(shí)測定五蟲化瘀通絡(luò)膠囊中阿魏酸、丹酚酸B 和丹參酮ⅡA 3 種指標(biāo)成分，結(jié)果表明該方法穩(wěn)定可靠、靈敏度高，可用于五蟲化瘀通絡(luò)膠囊的質(zhì)量控制。