截短型轉(zhuǎn)化生長因子β II型受體對急性肝損傷小鼠炎癥因子表達(dá)的影響

黃 珍，王小花，初彥輝，劉海峰

(牡丹江醫(yī)學(xué)院 1.醫(yī)藥研究中心；2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011)

肝臟是人體代謝的重要器官，具有儲存肝糖和合成分泌性蛋白質(zhì)等重要功能。四氯化碳(CCl4)可誘導(dǎo)急性肝損傷，誘發(fā)炎癥并持續(xù)性損傷肝臟，進(jìn)而發(fā)展為肝硬化等多種慢性肝臟疾病，最終造成肝臟功能紊亂[1-2]。因而，急性肝損傷是影響肝功能的主要因素[3-4]，研發(fā)防治急性肝損傷的藥物對于維持正常的肝功能具有重要意義。課題組前期研究表明：截?cái)嘈偷霓D(zhuǎn)化生長因子β II型受體(tTβRII)可通過有效抑制TGF-β1功能而緩解慢性肝損傷[5]，但其對急性肝損傷炎癥細(xì)胞因子的影響尚未見報道。因此，本研究以注射CCl4誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷動物為研究對象，探討tTβRII對急性肝損傷炎癥指標(biāo)的影響，為急性肝損傷疾病的治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器四氯化碳(美國Sigma公司)；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(北京索萊寶公司)；兔抗鼠的TNF-α和IL-1β一抗(美國Proteintech公司)；羊抗兔的Ig G二抗(北京碧云天公司)；DAB顯色試劑盒(北京金杉公司)；RNA抽提試劑盒(美國Omega公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒SYBR Green Master(美國Roche公司)；TNF-α和IL-1β PCR引物(蘇州金唯智公司)；重組tTβRII由本實(shí)驗(yàn)室制備；熒光定量PCR儀(美國ABI公司)和光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1 急性肝損傷動物模型的制備和處理 SPF級C57BL/6J小鼠，雄性，體重18～22 g，由牡丹江醫(yī)學(xué)院動物中心提供，動物合格證號：SCXK(黑)2019-003，飼養(yǎng)期間動物自由進(jìn)食飲水，動物房光照節(jié)律12 h：12 h，適應(yīng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。將20只小鼠隨機(jī)分為4組，隨機(jī)分為空白對照組(control)、模型組(CCl4)、模型對照組(CCl4+PBS)和tTβRII處理組(CCl4+tTβRII)，每組5只。control組為每日9:00直接腹腔注射200 μL純橄欖油，1次/d，共4 d。CCl4組、CCl4+PBS組和CCl4+tTβRII組均每日9:00直接腹腔注射200 μL CCl4/橄欖油混合液，1次/d，共4 d，其中CCl4+PBS組和CCl4+tTβRII組在第3天和第4天當(dāng)日15:00直接尾靜脈注射PBS和目的蛋白tTβRII(60 μg)。最后一次注射24 h后，通過腹腔注射4%水合氯醛來麻醉小鼠，將分離的肝臟部分用于4%甲醛固定和組織脫水包埋，剩余肝臟保留于-80 ℃冰箱備用。

1.2.2 HE染色 將石蠟切片(5 μm)經(jīng)二甲苯脫蠟和梯度酒精脫水，然后經(jīng)蘇木素和伊紅染色，再依次經(jīng)梯度酒精脫水和二甲苯透明，最后滴加適量中性樹脂封片，烘干后常溫保存，并在普通光學(xué)顯微鏡下攝取圖像。

1.2.3 實(shí)時熒光定量PCR 提取肝臟RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR檢測TNF-α和IL-1β mRNA的表達(dá)水平，引物序列如表1。PCR反應(yīng)體系包括：cDNA 2 μL，正向和反向引物各0.8 μL，SYBR Green Mix熒光染料9 μL，無菌蒸餾水7.4 μL。反應(yīng)程序?yàn)?0 ℃升溫2 min；95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s；60 ℃退火1 min；72 ℃延伸10 s，擴(kuò)增40個循環(huán)，以GAPDH為內(nèi)參，測出樣品的相對表達(dá)[6]。

表1 實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增引物序列

1.2.4 免疫組化染色 按照常規(guī)免疫組化染色方法[7]，對各處理組中小鼠肝臟組織石蠟切片進(jìn)行TNF-α和IL-1β蛋白染色，光學(xué)顯微鏡攝取圖像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，多組間比較采用one way ANOVA分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 tTβRII對急性肝損傷小鼠肝組織病理變化的影響HE染色法檢測各組中肝組織的病理形態(tài)學(xué)變化，結(jié)果顯示：control組中肝小葉結(jié)構(gòu)完整、肝細(xì)胞形態(tài)完整，細(xì)胞核清晰可見；CCl4組中肝小葉排列紊亂，肝細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，并發(fā)生變性壞死；而與CCl4組相比，CCl4+tTβRII組中肝小葉結(jié)構(gòu)和肝細(xì)胞形態(tài)趨于正常，見圖1。

2.2 tTβRII對急性肝損傷小鼠肝組織中TNF-α和IL-1β mRNA表達(dá)的影響實(shí)時熒光定量PCR檢測各組炎癥細(xì)胞因子mRNAs的表達(dá)，結(jié)果顯示：與control組比較，CCl4組中促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β mRNA表達(dá)均明顯上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=202.322，P=5.5664E-8；F=72.595，P=0.000002)；與CCl4組比較，CCl4+tTβRII組中促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β mRNA表達(dá)明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=202.322，P=0.000001；F=72.595，P=0.007624)，見圖2。

圖2 tTβRII對急性肝損傷小鼠肝組織中TNF-α和IL-1β mRNA表達(dá)的影響

2.3 tTβRII對急性肝損傷小鼠肝組織中TNF-α和IL-1β蛋白表達(dá)的影響免疫組化檢測各組炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，結(jié)果顯示：與control組比較，CCl4組中棕色沉淀物明顯增加，說明促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β蛋白表達(dá)明顯上升；與CCl4組比較，tTβRII處理組(CCl4+tTβRII)中棕色沉淀物減少，說明促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β蛋白表達(dá)明顯降低，見圖3。

圖3 tTβRII對急性肝損傷小鼠肝組織中TNF-α和IL-1β蛋白表達(dá)的影響

3 討論

急性肝損傷是各種毒素和藥物引發(fā)的肝組織病理改變，其與肝組織中細(xì)胞的氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡和炎癥等密切相關(guān)[8-10]。若不能及時得到有效治療，將發(fā)展為肝衰竭而影響人類生存。CCl4是誘導(dǎo)急性肝損傷的經(jīng)典毒物，可通過調(diào)控TGF-β1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)而影響炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)。因此，炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)與急性肝損傷密切相關(guān)[11-13]。

TGF-β1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路具體表現(xiàn)為：TGF-β1與細(xì)胞膜上轉(zhuǎn)化生長因子β II型受體(TβRII)結(jié)合，使其磷酸化，進(jìn)而結(jié)合并磷酸化轉(zhuǎn)化生長因子β I型受體(TβRI)，進(jìn)一步將胞外信號傳遞至細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，最終影響下游靶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯而調(diào)控靶基因的生物學(xué)功能[14-16]。因此，TβRII的磷酸化與TGF-β1信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)密切相關(guān)，阻止TβRII磷酸化可有效抑制該信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)。課題組前期已篩選到截?cái)嘈蚑βRII(即刪除TβRII的絲氨酸/蘇氨酸激酶區(qū)域)可與野生型TβRII在體內(nèi)外競爭性結(jié)合TGF-β1。綜上所述，該tTβRII在急性肝損傷的防治中具有重要的應(yīng)用前景。

本研究將制備tTβRII作用于CCl4誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷動物模型，通過檢測炎癥細(xì)胞因子的變化來探討其防治急性肝損傷的可能。HE染色結(jié)果表明，CCl4破壞小鼠的肝組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)為肝小葉排列紊亂，以及肝細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，并發(fā)生變性壞死，而經(jīng)tTβRII處理后，肝小葉排列趨于規(guī)則，肝細(xì)胞形態(tài)趨于完整；說明tTβRII可通過抑制急性肝損傷小鼠肝組織中促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，降低其對肝細(xì)胞的損傷而使其結(jié)構(gòu)趨于正常。另外，實(shí)時熒光定量PCR和免疫組化結(jié)果表明，CCl4上調(diào)肝組織中促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β mRNA和蛋白表達(dá)，而經(jīng)tTβRII處理后，TNF-α和IL-1β mRNA和蛋白表達(dá)均降低，說明tTβRII可在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平上抑制促炎細(xì)胞因子的表達(dá)來緩解CCl4引起的急性肝損傷。課題組將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中闡明其與炎癥反應(yīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)鍵效應(yīng)分子間的關(guān)系，進(jìn)一步明確tTβRII對急性肝損傷的保護(hù)的分子作用機(jī)制。

綜上所述，目的蛋白tTβRII對CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷具有一定的保護(hù)作用，其作用可能是通過影響炎癥細(xì)胞因子實(shí)現(xiàn)的，可為急性肝損傷的防治提供理論依據(jù)。