基于Pro-197-Ser突變的抗雙氟磺草胺薺菜的快速檢測(cè)

李琦，于金萍，郭文磊，劉亦學(xué)，張惟

摘要：雙氟磺草胺是防除小麥田薺菜（Capsella bursa-pastoris）等闊葉雜草的主要除草劑品種之一，目前在我國(guó)河南、河北、天津等地已有薺菜種群對(duì)其產(chǎn)生了抗藥性。乙酰乳酸合成酶（ALS）基因第197位位點(diǎn)核苷酸突變是薺菜對(duì)雙氟磺草胺產(chǎn)生抗藥性的主要原因，通過在引物 D197F 序列的 3′ 端引入錯(cuò)配堿基，設(shè)計(jì)出一種衍生性酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列 （dCAPS） 分子標(biāo)記方法，可用于第197位位點(diǎn)核苷酸突變的快速檢測(cè)?？顾幮约懊舾兴j菜的ALS基因擴(kuò)增片段經(jīng)限制性內(nèi)切酶AvaⅡ酶切后表現(xiàn)出多態(tài)性，敏感薺菜產(chǎn)生了31、192 bp等2個(gè)片段;抗藥性薺菜產(chǎn)生了31、192、223 bp等3個(gè)片段。該方法檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，與整株水平測(cè)定結(jié)果一致，并適用于第197位位點(diǎn)的任意氨基酸取代。這種dCAPS分子標(biāo)記方法可對(duì)田間當(dāng)季雜草進(jìn)行檢測(cè)，可為薺菜種群抗藥性的快速檢測(cè)與監(jiān)測(cè)提供理論支持。

關(guān)鍵詞：薺菜;雙氟磺草胺;靶標(biāo)抗藥性;ALS基因;dCAPS

中圖分類號(hào)：S481.4;S482.4文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1003-935X（2021）02-0014-06

Rapid Detection of Pro-197-Ser Mutation Endowing Target-Site

Resistance to Florasulam in Capsella bursa-pastorisLI Qi1，YU Jinping1，GUO Wenlei2，LIU Yixue1，ZHANG Wei1

（1.Institute of Plant Protection，Tianjin Academy of Agricultural Sciences，Tianjin 300381，China;

2.Plant Protection Research Institute，Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Guangdong

Provincial Key Laboratory of High Technology for Plant Protection，Guangzhou 510640，China）Abstract：Florasulam is widely used in wheat fields to control Capsella bursa-pastoris and other broadleaf weeds. However，some C. bursa-pastoris populations have evolved resistance to florasulam in Henan，Hebei and Tianjin，China. The mutation occurring at ALS gene at 197 codon is a main mechanism causing florasulam resistance in C. bursa-pastoris. We introduced a mismatched base at 3′-end of the primer D197F and designed a dCAPS method to detect the mutation of ALS gene at 197 codon rapidly. The ALS fragments amplified between resistant and susceptible C. bursa-pastoris plants showed polymorphisms after digestion by the restriction enzyme AvaⅡ. The susceptible plants produced two fragments （31 bp and 192 bp）. Resistant plants produced three fragments （31 bp，192 bp and 223 bp）. Results were accurate and reliable，and were consistent with the whole-plant experiments. Moreover，the method was suitable for any mutations at ALS 197 codon by detecting resistance in season. This study provides a procedure to detect and monitor ALS herbicide-resistance in C. bursa-pastoris.

Key words：Capsella bursa-pastoris;florasulam;target resistance;ALS gene;dCAPS

薺菜（Capsella bursa-pastoris）是我國(guó)常見的闊葉雜草，廣泛分布于長(zhǎng)江流域、華北地區(qū)和西南地區(qū)作物田，主要危害油菜、稻茬麥、冬小麥等冬春作物。薺菜具有很強(qiáng)的耐低溫及耐干旱能力，環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，在田間與作物競(jìng)爭(zhēng)，嚴(yán)重影響著作物的質(zhì)量與產(chǎn)量[1]。雙氟磺草胺（florasulam）是由美國(guó)陶氏化學(xué)公司開發(fā)的三唑并嘧啶磺酰胺類除草劑，被廣泛用于防除小麥田闊葉雜草，其作用機(jī)制是通過抑制乙酰乳酸合成酶（ALS）的活性，使雜草無法合成亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸這 3種氨基酸而死亡，是一種典型的乙酰乳酸合成酶抑制劑[2]。

由于具有高選擇性、高活性、低毒、低殘留的特點(diǎn)，乙酰乳酸合成酶抑制劑類除草劑被長(zhǎng)期大量使用，導(dǎo)致雜草抗藥性的發(fā)生非常嚴(yán)重，截至目前，全球已有165種雜草對(duì) ALS類除草劑產(chǎn)生了抗藥性[3-4]。除草劑作用靶標(biāo)位點(diǎn)的氨基酸發(fā)生突變，影響除草劑與靶標(biāo)酶的結(jié)合是抗藥性產(chǎn)生最普遍的分子機(jī)制。目前，有報(bào)道顯示，ALS基因中有8個(gè)氨基酸位點(diǎn)發(fā)生的27種氨基酸突變形式與抗藥性相關(guān)[4]。根據(jù)報(bào)道，薺菜對(duì)ALS類除草劑產(chǎn)生抗藥性的靶標(biāo)機(jī)制包括Pro-197-His、Pro-197-Leu、Pro-197-Arg、Pro-197-Thr、Pro-197-Ser、Pro-197-Ala、 Trp-574-Leu等7種氨基酸突變形式[5-6]。

雜草對(duì)除草劑產(chǎn)生抗藥性是一個(gè)不斷發(fā)展和演化的過程[7]，因此，加強(qiáng)對(duì)田間抗藥性雜草的調(diào)查[8-9]，對(duì)處于抗藥初期的雜草進(jìn)行準(zhǔn)確快速的檢測(cè)，才能最大程度地減少抗藥性雜草對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的危害。目前，常用于雜草抗藥性檢測(cè)的方法主要有溫室整株植物鑒定法[10]、抗性當(dāng)季快速檢測(cè)（resistance in season quick test，RISQ） 法[11]、種子培養(yǎng)皿法[12]、靶標(biāo)酶基因測(cè)序法[13]、酶切擴(kuò)增多態(tài)性檢測(cè)法[14]等。其中，溫室整株植物鑒定法、RISQ法與種子培養(yǎng)皿法簡(jiǎn)單易行，結(jié)果直觀，對(duì)試驗(yàn)儀器要求低，可以針對(duì)不同雜草的各種抗藥性機(jī)制進(jìn)行檢測(cè)，但是檢測(cè)效率低、速度慢，需要占用大量的試驗(yàn)空間，不適宜于大量樣品同時(shí)檢測(cè);靶標(biāo)酶基因測(cè)序法的結(jié)果準(zhǔn)確，已廣泛應(yīng)用于多種除草劑抗藥性檢測(cè)中，但是該方法對(duì)試驗(yàn)儀器要求高，試驗(yàn)結(jié)果不夠直觀，須要進(jìn)行進(jìn)一步的生物學(xué)分析;酶切擴(kuò)增多態(tài)性檢測(cè)法（derived cleaved amplified polymorphic sequence，dCAPS） 通過在擴(kuò)增引物中引入錯(cuò)配堿基提供限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)，根據(jù)限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的酶切片段，判斷特定突變的基因和正常的基因，其操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)方便、結(jié)果直觀、成本低、周期短，可以對(duì)大量樣品同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，但其只能檢測(cè)已知的單一突變位點(diǎn)。本研究針對(duì)在薺菜中最常見的ALS基因197位突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)了 dCAPS 標(biāo)記方法，以期在薺菜抗藥性愈發(fā)嚴(yán)重的情況下，為其快速檢測(cè)提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1供試材料

雜草種子：2018年6月，從天津市薊州區(qū)小麥田采集薺菜種群TJ07;另從天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院核心區(qū)內(nèi)非耕地處（該地未使用過任何除草劑）采集1個(gè)種群作為敏感對(duì)照，編號(hào)為TJ12。薺菜種群采集信息見表1。

1.2主要儀器

ASS-4型化學(xué)農(nóng)藥實(shí)驗(yàn)自動(dòng)控制噴灑系統(tǒng)，購自北京盛恒天寶科技有限公司;5804R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，購自德國(guó) Eppendorf 公司;T100型PCR儀，購自美國(guó)Bio-Rad公司;DYY-8C型電泳儀，購自北京六一生物科技有限公司;HDL潔表1薺菜種群采集地點(diǎn)

Table 1Collection location of C. bursa-pastoris populations

種群編號(hào)采樣點(diǎn)經(jīng)緯度TJ07天津市薊州區(qū)侯家營(yíng)鎮(zhèn)韓莊子村39°52′36″N，117°16′3″ETJ12天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院核心區(qū)39°6′14″N，117°3′32″E

凈工作臺(tái)，購自北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司;RXZ-280C植物培養(yǎng)箱，購自寧波江南儀器廠;GL2200凝膠成像系統(tǒng)，購自美國(guó)柯達(dá)公司。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1薺菜對(duì)雙氟磺草胺的抗藥性水平測(cè)定采用整株水平測(cè)定法測(cè)定薺菜對(duì)雙氟磺草胺的抗藥性[15]。薺菜種子催芽方法同文獻(xiàn)[16]。將15粒露白的薺菜種子均勻地播種于直徑為12 cm的塑料盆內(nèi)，置于可控溫室中培養(yǎng)（自然光照，溫度為20～35 ℃，相對(duì)濕度為50%～70%）。生長(zhǎng)至2葉期時(shí)間苗，每盆留長(zhǎng)勢(shì)基本一致的薺菜10株。待長(zhǎng)至3～4葉期，用ASS-4型自動(dòng)農(nóng)藥定量噴霧系統(tǒng)進(jìn)行莖葉噴霧。噴霧壓力為0.275 MPa，噴液量為450 L/hm2。設(shè)定雙氟磺草胺的處理劑量（有效成分用量）：抗藥性（R）種群的為0、0.06、030、1.50、7.50、37.50、187.50 g/hm2;敏感（S）種群的為0、0.012、0.060、0.300、1.500、7.500、37.500 g/hm2。每個(gè)處理重復(fù)3次，試驗(yàn)共重復(fù)2次。噴藥后21 d，剪取薺菜地上部分，于恒溫干燥箱內(nèi)75 ℃烘干72 h，稱量干重并記錄。

1.3.2薺菜ALS基因片段克隆待薺菜生長(zhǎng)至4葉期后，采用植物基因組DNA提取試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司），從敏感、抗藥性種群中分別隨機(jī)選取5株薺菜以提取基因組DNA。采用已報(bào)道的2對(duì)引物序列[Forward 1 （5′-ATTCGTCTCCCGATTTGC-3′）/Reverse 1 （5′-GCCCGACACCAGTGCTTAT-3′）和Forward 2 （5′-GGTATCCCTGTTGCGAGTA-3′）? Reverse 2（5′-GCATACAAAGACCGTTTA-3′）]對(duì)薺菜ALS基因進(jìn)行擴(kuò)增[16]。引物由天津金唯智生物科技有限公司合成。PCR反應(yīng)體系包括1 μL基因組DNA模板、1 μL 正向引物（10 μmol/L），1 μL反向引物（10 μmol/L）、12.5 μL 10×Easy Taq SuperMix（北京全式金生物技術(shù)有限公司），加雙蒸水至總體積為25 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸90 s，34個(gè)循環(huán);72 ℃終延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，并將含目的條帶的擴(kuò)增產(chǎn)物送天津金唯智生物科技有限公司測(cè)序。將測(cè)序所得序列與NCBI上的薺菜ALS基因進(jìn)行比對(duì)，用軟件DNAMAN 6.0.3對(duì)擴(kuò)增出的敏感、抗藥性薺菜的ALS基因進(jìn)行比對(duì)分析。

1.3.3ALS 第197位位點(diǎn) dCAPS 檢測(cè)分析用dCAPS 在線設(shè)計(jì)工具 dCAPS Finder 2.0[17]及引物設(shè)計(jì)軟件 Primer Premier 5.0，通過在薺菜ALS基因197位點(diǎn)附近人為引入AvaⅡ酶切位點(diǎn)，使抗藥性、敏感薺菜的ALS基因片段經(jīng)限制性內(nèi)切酶AvaⅡ酶切后表現(xiàn)出多態(tài)性，設(shè)計(jì)出1對(duì)引物 D197F 和 D197R（表2）。敏感薺菜ALS基因片段被完全酶切，含有31、192 bp等2個(gè)片段;純合突變抗藥性薺菜無法被酶切，只有223 bp 1個(gè)片段;雜合突變抗藥性薺菜同時(shí)含有31、192、223 bp等3個(gè)片段。PCR反應(yīng)體系同“1.3.2”節(jié)。反應(yīng)條件：94 ℃ 預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，56 ℃退火 40 s，72 ℃延伸30 s，38個(gè)循環(huán);72 ℃終延伸 10 min。酶切反應(yīng)體系包括 4 μL PCR 產(chǎn)物、1 μL限制性內(nèi)切酶 （10 U/μL）、2 μL 10 × Buffer，加水至總體積為20 μL。限制性內(nèi)切酶AvaⅡ反應(yīng)溫度為37 ℃，酶切時(shí)間為30 min。酶切反應(yīng)完成后，加入2 μL 10 × Loading Buffer混勻，取10 μL至 2.5%瓊脂糖凝膠中，在1×TAE電泳緩沖液中120 V電壓下電泳25 min。結(jié)束后通過紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。

1.3.4數(shù)據(jù)處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用雙邏輯非線性回歸模型y=C+{（D-C）/[1+（x/GR50） b]}擬合劑量反應(yīng)曲線，計(jì)算抑制50%薺菜生長(zhǎng)所需的除草劑劑量（GR50）。式中：y為除草劑某一劑量下薺菜干重相對(duì)于空白對(duì)照的百分比;x為除草劑表2用于薺菜 ALS 第197位位點(diǎn) dCAPS 分析的引物信息

Table 2Primers used for dCAPS in ALS 197 codon of C. bursa-pastoris

引物序列（5′→3′）目標(biāo)氨基酸位點(diǎn)退火溫度

（℃）酶識(shí)別位點(diǎn)預(yù)計(jì)酶切后片段大?。╞p）野生型突變型D197FGTTCCTCTTGTAGCAATCACAGGACAGGTCPro197，CCT56AvaⅡ，GGWCC192，31223D197RGTTGCTGGATATCTTTAGGAATA注：引物中加粗及下劃線顯示的堿基表示人為設(shè)計(jì)的錯(cuò)配以引入AvaⅡ切酶位點(diǎn);限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)包含的堿基在引物和目標(biāo)氨基酸位點(diǎn)中用下劃線標(biāo)出。

劑量;C為劑量反應(yīng)下限;D為劑量反應(yīng)上限;b為斜率。

抗性倍數(shù) （resistance index，RI）計(jì)算公式為RI=抗性種群的GR50/敏感種群的GR50。參考Beckie等的方法[18]對(duì)抗性倍數(shù)進(jìn)行分級(jí)：敏感為RI<2，低水平抗性為2≤RI<5，中水平抗性為5≤RI≤10，高水平抗性為RI>10。

2結(jié)果與分析

2.1薺菜對(duì)雙氟磺草胺的抗藥性水平

整株水平測(cè)定結(jié)果（表3）表明，薺菜種群TJ07對(duì)雙氟磺草胺產(chǎn)生了高水平抗藥性，GR50為8.3 g a.i./hm2，與敏感種群TJ12相比抗性倍數(shù)為16.6。表3薺菜種群對(duì)雙氟磺草胺的抗性水平

Table 3Resistance ratio of C. bursa-pastoris populations to florasulam

種群回歸方程參數(shù)CDbGR50

（g a. i./hm2）抗性倍數(shù)

（倍）TJ070.0440.428-0.5428.3±7.416.6TJ120.1630.431-0.8650.5±0.21.0注：GR50數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2.2ALS基因片段測(cè)序

測(cè)序結(jié)果顯示，擴(kuò)增所得ALS基因片段長(zhǎng)度為1 738 bp，與NCBI中薺菜ALS基因序列（HQ880660.1）同源性達(dá) 99%以上，并且包含所有已經(jīng)報(bào)道的8個(gè)抗性氨基酸突變位點(diǎn)。將抗藥性種群和敏感種群的ALS基因序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)抗藥性種群TJ07的5株被測(cè)植株中均存在? Pro-197-Ser （CCT-TCT）氨基酸突變形式，敏感種群TJ12的5株被測(cè)植株中均未發(fā)現(xiàn)已證實(shí)的ALS基因突變（圖1）。

2.3薺菜ALS基因第197位位點(diǎn) dCAPS 檢測(cè)分析

本研究針對(duì)敏感薺菜ALS基因第197位位點(diǎn)設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)，使擴(kuò)增的敏感薺菜ALS基因片段能夠被限制性內(nèi)切酶識(shí)別并酶切。在引物D197F中引入1個(gè)錯(cuò)配堿基，使得敏感ALS基因在第197位位點(diǎn)生成了1個(gè)AvaⅡ的酶切位點(diǎn)（GGWCC）。

以“2.2”節(jié)中薺菜基因組DNA為模板，采用引物D197F/D197R對(duì)5株抗藥性植株、5株敏感植株均擴(kuò)增出一條223 bp的目的片段，與預(yù)期一致。用限制性內(nèi)切酶AvaⅡ?qū)CR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，通過觀察電泳圖譜，5株敏感植株產(chǎn)生了31、192 bp 等2個(gè)條帶，5株抗藥性植株產(chǎn)生了31、192、223 bp 等3個(gè)條帶，但因 31 bp 的條帶較小，無法在電泳圖譜上顯示（圖2）。

3討論與結(jié)論

雜草對(duì)除草劑產(chǎn)生抗藥性是一個(gè)不斷發(fā)展的過程。據(jù)報(bào)道，ALS 抑制劑類除草劑在同一地塊連續(xù)重復(fù)使用3年以上，就可導(dǎo)致該地塊雜草產(chǎn)生抗藥性[19]。雙氟磺草胺是應(yīng)用廣泛的一種麥田莖葉處理劑，若因雜草抗藥性導(dǎo)致防效差，會(huì)增加作物減產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)。因此，加強(qiáng)對(duì)田間抗藥性雜草的發(fā)生區(qū)域調(diào)查及監(jiān)測(cè)在抗藥性雜草的治理中變得尤為重要。

目前常用的抗藥性雜草檢測(cè)方法，根據(jù)雜草的檢測(cè)層次可以分為表型檢測(cè)、生理生化檢測(cè)、分子檢測(cè)等[20]。表型檢測(cè)一般是指以生存率、死亡率、生物量等檢測(cè)指標(biāo)去比較除草劑對(duì)抗敏植株效果的生物測(cè)定方法。鄒紅梅等采用瓊脂法實(shí)現(xiàn)了菵草對(duì)3種乙酰輔酶A羧化酶（ACCase）抑制劑的快速檢測(cè)[21]，該類方法簡(jiǎn)單易行，可檢測(cè)不同抗藥性機(jī)制，但需要較大空間，試驗(yàn)周期偏長(zhǎng)，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，人為因素影響較大。生理生化檢測(cè)一般是指通過測(cè)定除草劑靶標(biāo)酶及相關(guān)代謝酶的活性，判斷是否存在抗藥性，該方法對(duì)試驗(yàn)技術(shù)及試驗(yàn)環(huán)境要求較高。分子檢測(cè)是基于核酸水平，對(duì)目的植物基因進(jìn)行分析的一種檢測(cè)方法，該類方法較多，不同的方法之間差別較大，對(duì)試驗(yàn)技術(shù)、試驗(yàn)設(shè)備以及試驗(yàn)成本的要求也不同。崔海蘭等通過對(duì)靶標(biāo)酶基因的擴(kuò)增及測(cè)序，建立了豬殃殃靶標(biāo)抗藥性快速檢測(cè)方法[22]，但該方法在2次測(cè)序反應(yīng)以后，需要專業(yè)軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行生物分析，對(duì)試驗(yàn)人員要求較高，不適宜大規(guī)模推廣。

ALS基因發(fā)生核苷酸突變已被大量研究證明是雜草對(duì)ALS抑制劑類除草劑產(chǎn)生抗藥性的主要機(jī)制之一[3]。本研究通過引物D197F的錯(cuò)配堿基引入內(nèi)切酶AvaⅡ （GGWCC）酶切位點(diǎn)，采用dCAPS方法可檢測(cè)薺菜中ALS基因第197位的Pro-197-Ser （CCT-TCT）氨基酸突變形式。該方法對(duì)5株抗藥性植株和5株敏感植株的測(cè)定結(jié)果具有良好的一致性，說明本研究設(shè)計(jì)的 dCAPS分析方法可對(duì)雙氟磺草胺抗藥性薺菜Pro-197-Ser突變進(jìn)行準(zhǔn)確可靠的檢測(cè)。目前，薺菜被報(bào)道的ALS197位點(diǎn)突變形式主要有以下幾種：Pro-197-His （CCT-CAT）、Pro-197-Leu （CCT-CTT）、Pro-197-Arg （CCT-CGT）、Pro-197-Thr （CCT-ACT）、Pro-197-Ser （CCT-TCT）、Pro-197-Ala （CCT-GCT）[23]，雖然發(fā)生突變的堿基不同，但均為第197位密碼子的前2位堿基，而這2個(gè)堿基均包含在AvaⅡ內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)上，因此，本方法可以檢測(cè)到第197位位點(diǎn)多種形式的核苷酸變化。本研究中所檢測(cè)的TJ07種群，所有突變均為雜合，這可能是因?yàn)樗j菜中含有多個(gè)ALS基因拷貝，使用dCAPS方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示的雜合是部分同源染色體雜合性，不是等位基因雜合[21]。

加強(qiáng)對(duì)田間抗藥性雜草的發(fā)生區(qū)域調(diào)查及監(jiān)測(cè)，有利于在雜草抗藥性發(fā)展初期進(jìn)行防治，最大程度減少抗藥性雜草對(duì)農(nóng)業(yè)造成的危害。本研究構(gòu)建了薺菜ALS基因第197位位點(diǎn)突變的dCAPS檢測(cè)方法，該方法操作簡(jiǎn)單、結(jié)果直觀，可對(duì)田間當(dāng)季雜草進(jìn)行檢測(cè)。由于該方法只能對(duì)已知的單一靶標(biāo)突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)于未知的突變位點(diǎn)以及非靶標(biāo)抗藥性須要結(jié)合其他檢測(cè)方法鑒定。

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收稿日期：2020-11-30

基金項(xiàng)目：天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所所長(zhǎng)創(chuàng)新基金（編號(hào)：20190001S）。

作者簡(jiǎn)介：李琦（1990—），男，山東濟(jì)寧人，博士，助理研究員，主要從事農(nóng)田雜草防除及雜草抗性機(jī)理研究。E-mail：liqi0309@hotmail.com。

通信作者：劉亦學(xué)，碩士，副研究員，主要從事除草劑應(yīng)用技術(shù)研究。E-mail：liuyixue113@163.com。