茯苓四逆湯調(diào)節(jié)TLR-4/NF-κB 通道對(duì)膿毒癥大鼠心肌抑制的保護(hù)機(jī)制研究*

黃壑霏，彭曉洪，黃亞秀，陳冬杰，黃永蓮，王評(píng)

廣東省深圳市北京中醫(yī)藥大學(xué)深圳醫(yī)院（龍崗） 廣東深圳 518172

關(guān)健詞 茯苓四逆湯；膿毒癥；TLR -4/NF-κB 信號(hào)通路；心肌抑制

膿毒癥病情兇險(xiǎn)，一旦發(fā)生，治療難度大，死亡率高[1]。炎癥反應(yīng)是膿毒癥的重要發(fā)病機(jī)制之一，也是誘發(fā)多臟器損傷的重要疾病基礎(chǔ)[2]。膿毒癥極易并發(fā)心肌抑制[3-4]，由此成為膿毒癥患者主要死亡原因之一[5]。膿毒癥心肌抑制發(fā)病機(jī)制尚不明確，與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等多種因素相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，Toll樣受體4（Toll like receptor 4，TLR-4）通過(guò)識(shí)別脂多糖而激活單核細(xì)胞，最終活化核轉(zhuǎn)錄因子-κB（Nuclear transcription factor-κB，NF-κB）通路，使白介素-6（Interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）等表達(dá)上調(diào)，從而激活炎癥反應(yīng)[6-7]。目前，膿毒癥心肌抑制無(wú)特異性治療，相關(guān)對(duì)癥治療藥物對(duì)預(yù)后的改善不明確。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)[8-9]，多種中藥復(fù)方通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)減輕膿毒癥大鼠心肌損傷、進(jìn)而改善預(yù)后。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，茯苓四逆湯可以降低慢性心衰患者血清TNF-α水平[10]，減輕老年膿毒癥大鼠心肌損傷，降低死亡率[11]。本研究觀察該方對(duì)膿毒癥大鼠心肌炎癥因子表達(dá)的影響，探討其心肌保護(hù)的作用機(jī)制。

材料與方法

1 試驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí) SD雄性大鼠 120只，體重（210g±20）g，購(gòu)自斯萊克動(dòng)物研究中心（許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0005）。實(shí)驗(yàn)開(kāi)展前已通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)審查。

2 試藥與儀器

2.1 藥物 茯苓四逆湯組成：干姜8g，制附子10g，人參5g，茯苓30g，炙甘草10g，由本院中藥房提供，煎煮成含原生藥1g/mL，過(guò)濾除菌分裝4℃保存?zhèn)溆谩⒄瘴墨I(xiàn)[12]計(jì)算灌胃劑量，210g大鼠等效劑量為1.3g，低、中、高劑量分別為 1.3g/d、2.6g/d、3.9g/d。

2.2 試劑 GAPDH（美國(guó)CS公司），BCA法蛋白濃度測(cè)定盒（深圳輝諾生物科技公司），磁珠法組織RNA提取試劑盒（北京天根生化公司），兔抗大鼠NF-κB抗體、兔抗大鼠心型脂肪酸結(jié)合蛋白（Heart type fatty acid binding protein，H-FABP）抗體、內(nèi)參Gapdh單抗、羊抗小鼠二抗及羊抗兔二抗（Abcam，英國(guó)）。3）儀器：臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)（美國(guó)Sorvall，F(xiàn)resco D-37520型），PCR儀（美國(guó) ABI公司，7500型），電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司，HWS28型），凝膠成像系統(tǒng)（上海天能，GIS2009型），蛋白電泳儀、電轉(zhuǎn)儀、雜交箱和酶標(biāo)儀，均為美國(guó)Bio-Rad公司生產(chǎn)，移液器（美國(guó)Gilson公司），組織勻漿器（美國(guó)Pro Scientific，PRO200型）等。

3 分組與動(dòng)物模型制備

3.1 分組 所有大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為6組：正常組，假手術(shù)組、模型組、中藥低、中、高劑量組，每組20只。

3.2 動(dòng)物模型制備 采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù) （cecal ligation and puncture，CLP）法造模。予0.4mL/kg 10%水合氯醛注射大鼠腹腔，將麻醉后大鼠固定，消毒腹部皮膚后切開(kāi)劍突下2cm處腹壁，分離出盲腸，在1/3處結(jié)扎后使用21G針頭貫通擠壓出少許腸內(nèi)容物，將其回納腹腔并縫合腹壁。術(shù)后予液體復(fù)蘇及復(fù)溫，單獨(dú)喂養(yǎng)。假手術(shù)組：開(kāi)腹分離盲腸，但不結(jié)扎及穿刺，盲腸回納后關(guān)腹。正常組不做任何處理。

4 干預(yù)方法

造模成功后，大鼠正常喂養(yǎng)。中藥低、中、高劑量組予相應(yīng)劑量茯苓四逆湯（1.3g/d，2.6g/d，3.9g/d），加生理鹽水稀釋至5ml，造模成功后6h灌胃，分兩次給藥，連續(xù)3d，正常組、假手術(shù)組、模型組同時(shí)間點(diǎn)予等量生理鹽水灌胃。

5 觀察指標(biāo)

5.1 一般項(xiàng)目觀察及取材 觀察大鼠的生存狀態(tài)（精神狀態(tài)、飲食、體質(zhì)量等），記錄大鼠生存時(shí)間。各組于術(shù)前及術(shù)后24h、48h、72h各取5只大鼠處死，取出新鮮心臟樣本后，用液氮速凍，-80℃保存。

5.2 心肌組織IL-6、TNF-α含量測(cè)定 心肌組織勻漿后，12000rpm離心5min，取上清，采用ELISA法檢測(cè)IL-6、TNF-α含量，操作按試劑盒（深圳輝諾生物科技公司）說(shuō)明進(jìn)行。

5.3 Western blott檢測(cè) H-FABP、NF-κB蛋白表達(dá)

將心肌組織切碎，加入RIPA裂解液后在勻漿機(jī)中研磨，充分裂解后，12000rpm離心5min，取上清，采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度，經(jīng)灌膠、電泳、電轉(zhuǎn)、封閉后分別與NF-κB、H-FABP及Gapdh的一抗（抗體滴度分別為1：1000，1：5000）4℃雜交過(guò)夜，然后TBST洗膜3次，與辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔二抗（Jackson 1∶5000）作用室溫孵育2h，再次洗膜5次，加ECL顯色，上機(jī)檢測(cè)。以 GAPDH條帶作為內(nèi)參，結(jié)果用靶蛋白/GAPDH 灰度比值表示。

5.4 QPCR檢測(cè)TLR4 mRNA表達(dá) 將心肌組織切碎，液氮研磨成粉狀，加入RIPA裂解液漩渦震蕩混勻，采用磁珠吸附方法抽提組織RNA。使用RTreagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara生產(chǎn)，貨號(hào)RR047A），將1μg RNA 樣本反轉(zhuǎn)錄成cDNA進(jìn)行后續(xù)RT-PCR檢測(cè)。RT-PCR檢測(cè)采用SYBR Premix Ex Taq試劑盒（深圳輝諾生物科技公司生產(chǎn)，貨號(hào)MX200017），嚴(yán)格按照操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。采用Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System 系統(tǒng)，兩步法 PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行PCR反應(yīng)。相關(guān)基因引物序如下：rTLR4：CCGCTCTGGCATCATCTTCATGGGTTTT AGGCGCAGAGTT，rGAPDH：AGGTGACCGCATCTTCTTGTTACGGCCAAATCCGTTCACA。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。計(jì)量數(shù)據(jù)以（）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。P＜0.05顯示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 一般性觀察

模型組大鼠前24h死亡3只，24～48h死亡2只，普遍出現(xiàn)進(jìn)食水減少、蜷縮、毛發(fā)蓬松、精神萎靡等癥狀。低、中劑量組前24h各有1只大鼠死亡，高劑量組無(wú)死亡大鼠。中藥各組大鼠癥狀較模型組輕。模型組死亡率高于中藥各組總死亡率（χ2=6.23，P=0.012）。假手術(shù)組大鼠術(shù)后進(jìn)食及活動(dòng)量有所下降，后逐漸恢復(fù)正常。正常組活動(dòng)及進(jìn)食正常。

2 各組TNF-ɑ、IL-6水平比較

模型組及中藥各劑量組心肌TNF-ɑ、IL-6含量術(shù)后均較正常組明顯升高（P＜0.01）。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，TNF-ɑ、IL-6含量逐漸降低。中藥各組與模型組同時(shí)間點(diǎn)TNF-ɑ、IL-6比較差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；中藥各組之間比較，劑量越高，TNF-ɑ、IL-6降低越明顯（P＜0.01或P＜0.05）。見(jiàn)表 1。

表1 各組TNF-ɑ、IL-6水平比較（）

表1 各組TNF-ɑ、IL-6水平比較（）

注：與正常組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01；與低劑量組比較，cP＜0.05，dP＜0.01；與中劑量組比較，eP＜0.05

指標(biāo) 時(shí)間 只數(shù) 正常組/pg·mL-1假手術(shù)組/pg·mL-1模型組/pg·mL-1低劑量組/pg·mL-1中劑量組/pg·mL-1高劑量組/pg·mL-1 IL-6術(shù)前 5 189.64±5.81 187.35±6.02 191.86±9.41 188.92±12.91 189.82±8.32 187.08±10.86術(shù)后 24h 5 187.43±5.85 195.35±7.93 585.22±31.52a 472.62±16.34ab 361.48±12.42abc 291.34±14.68abde術(shù)后 48h 5 187.57±5.78 192.61±7.52 455.07±25.42a 377.47±15.73ab 294.35±14.54abc 255.88±14.23abde術(shù)后 72h 5 188.78±5.63 194.45±8.31 374.71±12.73a 300.92±25.04ab 266.45±18.95abc 212.76±16.54abde TNF-ɑ術(shù)前 5 182.44±9.33 184.14±8.37 183.52±10.85 185.35±10.26 184.37±9.26 183.63±11.42術(shù)后 24h 5 183.71±9.42 189.72±9.15 677.83±62.76a 585.92±43.07ab 486.23±25.33abc 422.86±32.04abde術(shù)后 48h 5 180.18±9.47 188.37±8.98 527.84±40.34a 477.79±32.45ab 395.49±22.45abc 342.24±32.87abde術(shù)后 72h 5 184.22±9.84 186.28±8.27 409.66±52.85a 381.46±20.66ab 284.16±26.97abc 228.66±33.05abde

3 各組NF-κB、H-FABP蛋白表達(dá)比較

正常組、假手術(shù)組心肌組織NF-κB 和H-FABP蛋白表達(dá)水平低。模型組及中藥各劑量組造模成功后檢測(cè)到的蛋白水平比正常組均明顯升高（P＜0.05）；中藥各劑量組與模型組同時(shí)間點(diǎn)NF-κB、H-FABP蛋白表達(dá)比較差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；中藥不同組間對(duì)比，劑量越高，心肌組織NF-κB 、H-FABP蛋白表達(dá)下調(diào)越顯著（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組心肌組織NF-κB、H-FABP蛋白表達(dá)水平比較（）

表2 各組心肌組織NF-κB、H-FABP蛋白表達(dá)水平比較（）

注：與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比，bP＜0.05；與低劑量組比較，cP＜0.05

指標(biāo) 時(shí)間 只數(shù) 正常組 假手術(shù)組 模型組 低劑量組 中劑量組 高劑量組NF-κB術(shù)前 5 1.01±0.02 1.02±0.03 1.01±0.04 1.01±0.02 1.03±0.04 1.04±0.03術(shù)后 24h 5 1.03±0.03 1.05±0.06 3.18±0.21a 2.74±0.17ab 2.16±0.12ab 1.76±0.15abc術(shù)后 48h 5 1.05±0.02 1.03±0.05 2.59±0.22a 1.92±0.21ab 1.47±0.15ab 1.25±0.11bc術(shù)后 72h 5 1.04±0.03 1.10±0.12 2.11±0.17a 1.66±0.14 ab 1.22±0.08b 1.11±0.05bc H-FABP術(shù)前 5 1.54±0.12 1.52±0.13 1.53±0.11 1.52±0.10 1.55±0.12 1.57±0.13術(shù)后 24h 5 1.55±0.13 1.63±0.16 3.69±0.26a 3.02±0.21ab 2.95±0.20ab 2.46±0.18abc術(shù)后 48h 5 1.52±0.11 1.59±0.15 3.35±0.22a 2.74±0.18ab 2.57±0.18ab 2.14±0.17 abc術(shù)后 72h 5 1.55±0.14 1.62±0.16 2.71±0.14a 2.12±0.13ab 1.85±0.15b 1.66±0.14bc

4 各組心肌組織TLR-4 mRNA 表達(dá)比較

與正常組比較，模型組和中藥各劑量組心肌TLR-4mRNA表達(dá)均明顯升高（P＜0.01）；隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，TLR-4mRNA表達(dá)下降，與模型組比較，中藥各劑量組TLR-4 mRNA表達(dá)下降明顯，劑量越高，降低的越明顯（P＜0.01 或P＜0.05）。見(jiàn)表 3。

表3 各組心肌組織TLR-4 mRNA 表達(dá)比較（）

表3 各組心肌組織TLR-4 mRNA 表達(dá)比較（）

注：與正常組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05，cP＜0.01，與低劑量組比較，dP＜0.01，與中劑量組比，eP＜0.05.

時(shí)間 只數(shù) 正常組 假手術(shù)組 模型組 低劑量組 中劑量組 高劑量組術(shù)前 5 0.96±0.14 1.06±0.19 1.03±0.18 1.02±0.16 1.06±0.15 1.04±0.12術(shù)后 24h 5 1.01±0.13 1.07±0.18 34.66±6.19a 26.96±4.74ab 19.81±4.17ac 11.74±3.18acde術(shù)后 48h 5 0.98±0.15 0.96±0.16 22.89±4.62a 16.73±3.63ab 9.75±2.21ac 4.37±1.08acde術(shù)后 72h 5 1.02±0.15 0.97±0.15 14.62±3.41a 7.56±1.29 ab 4.63±1.59ac 1.79±0.45cde

討 論

膿毒癥的本質(zhì)是感染誘發(fā)的器官功能障礙，其中心肌抑制尤為常見(jiàn)，其誘發(fā)的嚴(yán)重心衰是導(dǎo)致膿毒癥患者死亡的重要原因[13]。炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是膿毒癥心肌抑制的主要發(fā)病機(jī)制之一[14]。TNF-ɑ、IL-6是全身炎癥時(shí)候細(xì)胞分泌的重要炎癥介質(zhì)，并且在目前的相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中，發(fā)現(xiàn)TNF-ɑ可以促進(jìn)心肌炎性改變以及心肌細(xì)胞的凋亡從而引起心臟功能障礙[15]。H-FABP是診斷超早期心肌損傷的敏感標(biāo)志物，其特異性高[16]。研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥發(fā)生后1h 患者血清H-FABP水平已普遍升高，其升高程度與膿毒癥死亡率呈正相關(guān)[17]。TLRs 是一類(lèi)廣泛存在于血細(xì)胞、淋巴組織和心肝腎腦等重要臟器細(xì)胞膜上的固有免疫受體，可以介導(dǎo)宿主的免疫應(yīng)答反應(yīng)[18]。其中TLR4是識(shí)別革蘭陰性菌細(xì)胞外壁脂多糖成分的主要受體，并通過(guò)相關(guān)的信號(hào)通路激活NF-κB，活化的NF-κB啟動(dòng)眾多炎癥因子包括IL-6、TNF-α等的表達(dá)上調(diào)，而導(dǎo)致炎癥信號(hào)進(jìn)一步擴(kuò)大，從而加重心臟損傷。

本研究發(fā)現(xiàn)，在通過(guò)CLP法誘導(dǎo)制造動(dòng)物模型后，模型組及各中藥治療組的TNF-ɑ、IL-6的水平達(dá)均明顯升高，并在24h時(shí)到最高水平，其后開(kāi)始出現(xiàn)下降趨勢(shì)，且同時(shí)期NF-κB 和H-FABP蛋白表達(dá)水平及TLR4基因表達(dá)情況也在造模成功后24h達(dá)到最高峰，并隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸下降，而正常組及假手術(shù)組心肌組織TNF-ɑ、IL-6水平并沒(méi)有升高，而且同時(shí)NF-κB 和H-FABP蛋白表達(dá)及TLR4基因表達(dá)情況也未出現(xiàn)明顯變化，證明了出現(xiàn)全身炎癥反應(yīng)時(shí)，心肌細(xì)胞會(huì)受到抑制并出現(xiàn)損傷，該結(jié)果與國(guó)內(nèi)相關(guān)研究結(jié)果相一致[19-20]。

膿毒癥屬于中醫(yī)學(xué)外感熱病的范疇，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為膿毒癥的基本病因病機(jī)是正虛毒損、瘀滯絡(luò)脈。茯苓四逆湯由茯苓、人參、附子、甘草、干姜組成，具有扶正益氣，溫陽(yáng)通絡(luò)利水之功效。前期我們發(fā)現(xiàn)，茯苓四逆湯能抑制慢性心力衰竭患者炎癥反應(yīng)、改善臨床癥狀、減輕心肌重構(gòu)、提高患者生存質(zhì)量[21]。本研究中，中藥各組總體病死率低于模型組，且中藥各組心肌細(xì)胞TNF-α、IL-6水平較模型組明顯下降，其中，高劑量組作用更加明顯。說(shuō)明茯苓四逆湯可以抑制膿毒癥大鼠的炎癥反應(yīng)，減少炎癥因子的釋放，進(jìn)而改善預(yù)后。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，中藥各組心肌組織NF-κB的蛋白表達(dá)水平及TLR-4mRNA的表達(dá)水平均比模型組低，且隨著中藥濃度的增高差異越顯著，進(jìn)一步明確了茯苓四逆湯對(duì)心肌抑制的保護(hù)機(jī)制是通過(guò)抑制TLR-4介導(dǎo)的炎癥通路實(shí)現(xiàn)對(duì)膿毒癥心肌抑制的保護(hù)。

綜上，茯苓四逆湯能減少膿毒癥大鼠病死率，減輕膿毒癥大鼠心肌損傷，降低心肌細(xì)胞炎癥因子含量和心肌組織中NF-κB蛋白和TLR-4mRNA的表達(dá)，證實(shí)該保護(hù)作用是通過(guò)抑制 TLR4 介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)實(shí)現(xiàn)的。