恒溫?cái)U(kuò)增芯片法對住院患者下呼吸道感染病原譜分析

王克杰

(民航總醫(yī)院，北京 100123)

下呼吸道感染(Lower Respiratory Tract Infections，LRTI)是一種高治病率及高死亡率的疾病之一，世界衛(wèi)生組織2013年發(fā)布的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，下呼吸道感染(5.9%)位列十大死因第3位，位列第4位的慢性阻塞性肺病(5.4%)病死也多和感染相關(guān)。研究顯示，住院患者是LRTI死亡的主要人群，死亡率高達(dá)23%[1]，因此住院LRTI患者的診斷和治療應(yīng)受到重視。LRTI主要致病菌為革蘭陰性桿菌[2]。近年來，隨著病原診斷技術(shù)的提高，如核酸檢測和血清學(xué)分析等技術(shù)，非典型致病菌所占比例不斷提高[3,4]。因此，對下呼吸道感染的病原菌進(jìn)行分析總結(jié)，可為呼吸道疾病的預(yù)防與治療提供病原菌證據(jù)，加深對呼吸道細(xì)菌感染的認(rèn)識(shí)，以便能更好地進(jìn)行臨床針對性治療。目前細(xì)菌培養(yǎng)和血清學(xué)檢測是下呼吸道感染的主要實(shí)驗(yàn)室診斷方法，而現(xiàn)階段的診斷技術(shù)操作繁瑣，低效，陽性檢出率僅有30%～40%[5]，獲得結(jié)果周期較長，每次只能鑒定一種病原體，本研究采用恒溫?cái)U(kuò)增和微流控碟式芯片相結(jié)合的技術(shù)，對1份標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行13種下呼吸道病原體靶基因進(jìn)行擴(kuò)增和檢測，分析呼吸道感染細(xì)菌病原譜組成情況及流行病學(xué)特征，為呼吸道感染的抗菌治療提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2018～2020年呼吸科病房送檢的痰標(biāo)本，其中自然咳痰2581份，氣道下痰222例，氣管鏡引痰77例，肺泡灌洗液11例。男性1803例，女性1088例，年齡14～98歲，平均年齡70.42±15.925歲。臨床癥狀主要為發(fā)熱、咳嗽咳痰，伴或不伴胸痛及呼吸困難，查體呼吸音粗糙伴或不伴干/濕性噦音，胸部x線片或胸部cT掃描等影像學(xué)提示下呼吸道感染。

1.2 儀器與試劑

呼吸道病原菌核酸檢測試劑盒 ( 恒溫?cái)U(kuò)增芯片法 ) 購于生物公司。檢測采用 RTisochipTM-A 恒溫?cái)U(kuò)增微流控芯片核酸分析儀； II 級 B2 型生物安全柜；干式恒溫加熱器；臺(tái)式高速低溫冷凍離心機(jī)和微量移液器 。

1.3 恒溫?cái)U(kuò)增芯片法檢測病原體

1.3.1樣本前處理

向標(biāo)本中加入等體積 10% NaOH，充分震蕩，室溫液化大于30 min，取 1 mL 液化后的樣品轉(zhuǎn)移到1.5 mL 離心管中，12 000 rpm 離心 5 min，棄上清。再向離心管中加入 1 mL 洗液，充分震蕩后12 000 rpm離心 5 min，棄上清。最后，向離心管中加入 100 μL 核酸提取液，用移液器吹吸沉淀，將液體和沉淀一起轉(zhuǎn)移到核酸提取管中，震蕩10 min。 95℃ 加熱 5 min，10 000 rpm 離心1min，待用。

1.3.2 配置恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系

吸取融化離心后的20μL擴(kuò)增試劑到200μL空離心管，加入已提純好的34.5μL被檢核酸樣品，輕搖混合均勻，瞬時(shí)離心至管底。

1.3.3芯片加樣

取出芯片恢復(fù)室溫，用移液器吸取50μL上述配置好的核酸擴(kuò)增反應(yīng)體系，從芯片進(jìn)口加入到主通道中，將加樣后的芯片固定低速離心機(jī)上，以6000rpm離心30s后取下。

1.3.4核酸擴(kuò)增

用恒溫?cái)U(kuò)增微流控芯片核酸分析儀和相應(yīng)軟件進(jìn)行反應(yīng)和實(shí)時(shí)熒光分析，在具有鏈置換功能的聚合酶作用下，擴(kuò)增陽性的樣本會(huì)產(chǎn)生類似“ S”形擴(kuò)增曲線，一步完成對13種病原體基因的擴(kuò)增和檢測。

1.3.5結(jié)果判讀

試劑盒采用ROC法計(jì)算得到13種待檢病原的陽性判斷值，將各病原指標(biāo)的參考值整合至判斷軟件中，由軟件對樣品檢測結(jié)果進(jìn)行自動(dòng)判讀。當(dāng)檢測指標(biāo)的擴(kuò)增時(shí)間值≤ 該病原指標(biāo)的參考值時(shí)判讀為陽性。每個(gè)芯片內(nèi)均設(shè)1個(gè)陽性質(zhì)控和9個(gè)陰性質(zhì)控。

質(zhì)控結(jié)果正常 ( 陰性和陽性均正常 )，表明本次檢測結(jié)果有效，若任一結(jié)果錯(cuò)誤，則判定本次樣品檢測無效，需要進(jìn)行復(fù)檢，或重新送檢。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用 SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)和百分比表示，行卡方檢驗(yàn)(組間比較采用卡方分割檢驗(yàn))，P <0. 05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 芯片法病原體檢測結(jié)果

病原體的總陽性率為 59.88%(1731/2891)，13種病原體均檢測到，陽性率依次為：耐甲氧西林葡萄球菌33.9%，銅綠假單胞菌11.4%，肺炎克雷伯菌10.9%，鮑曼不動(dòng)桿菌9.9%，金黃色葡萄球菌9.2%，流感嗜血桿菌9.1%，嗜麥芽窄食單胞菌5.7%，肺炎鏈球菌4.7%，肺炎支原體2.9%，肺炎衣原體2.9%，結(jié)核分支桿菌復(fù)合群1.9%，嗜肺軍團(tuán)菌1例。其中，單一病原感染占34.5%(998/2891)，流感嗜血桿菌和肺炎支原體以單一感染常見，混合感染占25.4%(733/2891)，以耐甲氧西林葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌和鮑曼不動(dòng)桿菌多見，其中2種菌混合感染占14.1%(407/2891)，3種菌感染6.8%(197/2891)，4種菌感染2.9%(84/2891)，5種菌感染1.0%(29/2891)，6種菌感染0.5%(14/2891)，7種菌感染0.1%(2/2891)。見表1。

表1 病原體分布情況[n(%)]

續(xù)表1

2.2 病原菌檢出影響因素

2.2.1不同性別病原菌感染分布情況

2891例住院患者中，男性1803例，陽性率66.8%，女性1088例，陽性率33.2%，男性陽性率高于女性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2.2不同年齡分組病原菌感染分布情況

研究中，將14～45歲歸為青年組，46～69歲為中年組，>69歲為老年組。檢測后可見：肺炎鏈球菌、結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群、嗜肺軍團(tuán)菌在不同的年齡分組上陽性檢出率無差異(P>0.05)；肺炎衣原體、銅綠假單胞菌在青年中的感染與中年和老年不同，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；流感嗜血桿菌在中年組檢出率高于青年和老年組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、嗜麥芽窄食單胞菌以老年人感染明顯，對比青年和中年組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；耐甲氧西林葡萄球菌、鮑曼不動(dòng)桿菌與年齡正相關(guān)，年齡越大越容易感染；肺炎支原體與年齡負(fù)相關(guān)，年齡越小越容易感染。見表2。

表2 不同年齡病原體檢出分布(n)

2.2.3不同標(biāo)本類型病原菌感染分布情況

送檢標(biāo)本中：自然咳痰2582份，檢出陽性1480份，氣道下痰222份檢出陽性191份，氣道下痰、氣管鏡引痰的陽性檢出高于自然咳痰、肺泡灌洗液，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 不同的標(biāo)本類型病原體檢出率比較

2.2.4不同季節(jié)病原菌感染分布情況

肺炎鏈球菌、銅綠假單胞菌、結(jié)核分支桿菌復(fù)合群和嗜肺軍團(tuán)菌四季檢出無差異(P>0.05)；耐甲氧西林葡萄球菌四季都有高檢出率；春季流感嗜血桿菌多見；夏季以鮑曼不動(dòng)桿菌多見；秋季以肺炎克雷伯菌和金黃色葡萄球菌多見；冬季以流感嗜血桿菌多見。見表4。

表4 不同季節(jié)病原體檢出分布(n)

3 討論

感染性疾病以呼吸道感染為主，急性上呼吸道感染 90% 以上由病毒引起，急性下呼吸道感染常為細(xì)菌和病毒感染。引起下呼吸道感染的常見病原體包括大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌、克雷伯氏菌屬、不動(dòng)桿菌屬、金黃色葡萄球菌、腸球菌屬、凝固酶陰性葡萄球菌、嗜麥芽窄食單胞菌、肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、溶血鏈球菌和變形桿菌[6]。近年來，成人肺炎支原體感染報(bào)道增加，有資料顯示在成人社區(qū)獲得性肺炎( CAP)中， 肺炎支原體已經(jīng)成為感染率居首位的非典型病原體[7]。臨床上治療的重點(diǎn)在于及早、準(zhǔn)確發(fā)現(xiàn)致病菌及其耐藥性，因此準(zhǔn)確和快速診斷病原體對醫(yī)生指導(dǎo)患者臨床用藥有重要意義。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)以其靈敏度高，特異性強(qiáng)、對儀器設(shè)備要求低的特點(diǎn)得到廣泛的應(yīng)用，依據(jù)其原理設(shè)計(jì)的核酸檢測試劑盒已在國內(nèi)使用，與培養(yǎng)法和血清學(xué)法比較，有較好的一致性，更高的陽性檢出率和特異性[8-10]。呼吸道病原菌核酸檢測試劑盒利用恒溫?cái)U(kuò)增芯片技術(shù)及高速數(shù)字信號(hào)處理技術(shù)相結(jié)合，使檢測方法簡單快速、試劑耗量低、自動(dòng)化程度高，提高了檢測敏感性，具備了對呼吸道感染性疾病的快速診斷能力。

此次研究結(jié)果顯示住院患者呼吸道病原體感染陽性率為59.88%，13種病原體均檢測到，檢出率較高的依次為耐甲氧西林葡萄球菌33.9%、銅綠假單胞菌11.4%、肺炎克雷伯菌10.9%、鮑曼不動(dòng)桿菌9.9%、金黃色葡萄球菌9.2%、流感嗜血桿菌9.1%，與李艷燕等[11]的研究報(bào)道：恒溫?cái)U(kuò)增芯片法檢出病原體總體陽性率為58.27%，其中鮑曼不動(dòng)桿菌占21.05%、耐甲氧西林葡萄球菌20.30%、銅綠假單胞菌12.03%，基本相同。 也基本相同與陳愉生等[12]的研究報(bào)道：下呼吸道感染的病原菌主要是銅綠假單胞菌、流感嗜血桿菌、肺炎克雷伯菌和肺炎鏈球菌。研究結(jié)果顯示耐甲氧西林葡萄球菌陽性率較高，可能因?yàn)樵撛噭┖心图籽跷髁制咸亚蚓笜?biāo)由mecA基因指示，理論上不能排除為其他菌所攜帶，也可能存在院內(nèi)感染，與人工機(jī)械通氣、留置導(dǎo)管等有創(chuàng)操作有關(guān)，也與病人條件，抗生物使用情況有關(guān)。本次檢出耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)218例，占耐甲氧西林感染的22.2%(218 /980)，占金黃色葡萄球菌的81.6%(218 /267)，高于國內(nèi)其他研究[13]?？赡苡捎诒敬稳脒x住院患者多數(shù)為>69歲老年人，且長期住院，伴隨基礎(chǔ)疾病多，耐藥菌株既可由感染病人帶入醫(yī)院，也可因?yàn)E用抗生素在醫(yī)院內(nèi)產(chǎn)生，也可因檢測方法不同，MRSA的檢出率受孵育溫度、時(shí)間、培養(yǎng)基的pH和NaCl的濃度、菌液的數(shù)量等多種因素的影響，而恒溫?cái)U(kuò)增芯片法靈敏度高，最低檢測限為5×102拷貝/反應(yīng)，陽性排除污染，陰性結(jié)果不排除低拷貝數(shù)。此外檢測到1例嗜肺軍團(tuán)菌，由于其感染潛伏期較長、癥狀不典型，易導(dǎo)致漏診率、誤診率，是兒童呼吸道疾病中重要致病菌[14]，在成人中少見，檢出率較低[15]。本次結(jié)果提示檢出革蘭陰性菌(肺炎克雷伯菌，銅綠假單胞菌，鮑曼不動(dòng)桿菌，流感嗜血桿菌，大腸埃希菌)共1272例，革蘭陽性菌(耐甲氧西林葡萄球菌，肺炎鏈球菌，金黃色葡萄球菌)共1283例，檢出例數(shù)基本持平，這與張波等[16]研究不同，原因可能為其入選病例為慢阻肺合并肺部感染，而本次研究入選病例不限于慢阻肺，單純肺炎，發(fā)熱也包含在內(nèi)。本次還檢測出56例結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，由于結(jié)核的培養(yǎng)需要特殊的培養(yǎng)基，條件苛刻，其檢出時(shí)間長，不適用疾病的快速篩查，本次檢出結(jié)核復(fù)合群也經(jīng)其他PCR方法進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果一致，可見試劑盒有高準(zhǔn)確性，可運(yùn)用到病原譜的篩查。

研究結(jié)果顯示病原體的分布受性別的影響，這與王帆等[17]的研究結(jié)果不一致的，可能由于研究對象并非社區(qū)患者，在一定程度上可能存在統(tǒng)計(jì)偏倚，導(dǎo)致研究內(nèi)男性檢出率高于女性。關(guān)于年齡對檢出的影響，結(jié)果提示青年人(<45歲)多以肺炎支原體，肺炎衣原體感染多見，中年人(46～69歲)以流感嗜血桿菌多見，老年人以肺炎克雷伯感染多見，這與劉又寧等的研究結(jié)果相近[18]，而且青中年以單一感染為主，老年以混合感染為主，估計(jì)與老年人基礎(chǔ)疾病多，使用抗生素情況關(guān)。下呼吸道送檢痰液標(biāo)本要求白細(xì)胞大于25/低倍視野且上皮細(xì)胞<10/低倍視野為合格痰樣本，樣本量不少于0.6 mL，本次將痰分為4類，其中氣道下取痰和氣管鏡引痰的檢出率明顯高于自然咳痰和肺泡灌洗液，究其原因可能是氣道和氣管鏡采痰是從肺部感染患者的下呼吸道吸取，避開了口腔和上呼吸道菌群的污染，而自然咳痰影響因素較多：咳痰的時(shí)間(晨痰、飯前飯后)，咳痰方式(深咳，淺咳)等導(dǎo)致低檢出率，而肺泡灌洗液是采用纖維支氣管鏡經(jīng)鼻腔插管到達(dá)感染肺段，以溫生理鹽水 10 mL～20 mL 經(jīng)支氣管鏡快速注入，然后經(jīng)支氣管鏡負(fù)壓吸引，將灌洗液收集于無菌瓶內(nèi)送檢，本研究中只收到10例肺泡灌洗液，較其他類型的痰可以忽略不計(jì)，但是在馮利花等[20]的研究中顯示，肺泡灌洗液的檢出低于深部痰標(biāo)本，這與本研究結(jié)果一致。本次結(jié)果還提示不同季節(jié)病原體檢出不同，春季流感嗜血桿菌多見；夏季以鮑曼不動(dòng)桿菌多見；秋季以肺炎克雷伯菌和金黃色葡萄球菌多見；冬季以流感嗜血桿菌多見，與馮利花等[19]在兒童下呼吸道病原體檢測的研究不同，可以說明不同人群，在不同季節(jié)，病原譜分布不同。

研究的不足之處在于，沒有對入選病例進(jìn)行系統(tǒng)的疾病分型，沒有對比病原體在不同疾病中分布的差異性，也沒有對所檢出病原體進(jìn)行不同方法的對比研究。

綜上所述，下呼吸道感染的病原體種類多，分布受性別，年齡，季節(jié)，標(biāo)本類型，地域，患者情況，臨床抗生素用藥情況相關(guān)。臨床上根據(jù)患者所感染的病原體對患者進(jìn)行抗菌藥物的治療 ，對其治愈率沒有很大的影響 ，由于臨床上住院患者年齡都普遍較大 ，而且很多患者自身就伴隨著一些基礎(chǔ)性疾病 ，以致自身免疫力和抵抗力都很差 ，導(dǎo)致革蘭陰性菌和一些易感染球菌的情況十分常見 ，而目前這些患者的致病菌耐藥情況非常廣泛。恒溫?cái)U(kuò)增芯片試劑盒在診斷呼吸道病原體上準(zhǔn)確性高，特異性強(qiáng)，重復(fù)性好，抗干擾能力強(qiáng)，而且其臨床試驗(yàn)陽性符合率大于96%，陰性符合率大于99%，與培養(yǎng)結(jié)果一致性為67.4%，大大縮短了檢出時(shí)間，為本院呼吸科的臨床治療提供準(zhǔn)確使用抗菌藥物的依據(jù)，避免臨床的用藥混亂 ，降低患者感染病原體出現(xiàn)加急加重的概率 ，也縮短患者住院時(shí)間，節(jié)約住院費(fèi)用，同時(shí)降低抗菌藥物耐藥菌株的產(chǎn)生。該方法還可以推廣到醫(yī)院其他住院科室，甚至醫(yī)院院感的普查。