補(bǔ)陽還五湯對間歇低氧大鼠胰腺應(yīng)激蛋白及超微結(jié)構(gòu)的影響

劉 丹，吳潤華，魏 敏，陳 沁

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福建 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)臨床技能教學(xué)中心，福建 福州 350122）

睡眠呼吸暫停綜合征（OSAHS）是一種慢性睡眠障礙疾病，慢性間歇低氧（CIH）是其主要病理過程［1］。SENFT 等［2］研究發(fā)現(xiàn)，CIH 環(huán)境下細(xì)胞錯(cuò)誤蛋白與非折疊蛋白增多，由此產(chǎn)生了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）反應(yīng)，促進(jìn)胰島素抵抗（IR）形成。由此可見，OSAHS 和2型糖尿病在臨床上相互影響，相互促進(jìn)。研究表明，GRP78蛋白在ERS發(fā)生時(shí)表達(dá)上調(diào)，被認(rèn)為是 ERS 的標(biāo)志性因子［3］；在 ERS 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制中，最常見的信號通路為CHOP 和Caspase-12，它們的升高同樣提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生［4］。補(bǔ)陽還五湯為益氣活血之代表方劑［5］，在臨床上對于改善OSAHS 患者癥狀具有良好效果，本研究通過間歇低氧處理制備CIH 動物模型，探討補(bǔ)陽還五湯改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的機(jī)制，為臨床應(yīng)用中藥治療OSAHS提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動物 24 只 8 周齡 SD 雄性大鼠，SPF 級，體質(zhì)量（180±20）g，購自上海SLAC實(shí)驗(yàn)動物有限公司，實(shí)驗(yàn)動物許可證號：SCXK（滬2017-0005），批號：2007000531494。

1.2 試藥 補(bǔ)陽還五湯由黃芪30 g、當(dāng)歸尾9 g、赤芍12 g、地龍12 g、川芎 12 g、紅花 3 g、桃仁3 g 組成。將上述藥物置于煎煮鍋內(nèi)，加入5～7 倍藥材量的水浸泡1 h，沸水煮30 min，過濾，剩余藥渣再加入3～5倍量的水，沸水煮20 min，過濾。合并2次濾液，水浴濃縮至濃度為0.5 g/ml的藥液，冷卻后裝進(jìn)滅菌藥瓶內(nèi)，置于4 ℃保存。

1.3 試劑 胰島素放射免疫法測定試劑盒（北京北方生物技術(shù)研究所）；Rabbit anti-rat Caspase-12 抗體（SANTA CRUZ 公司）；CHOP 抗體（SANTA CRUZ公司）；二抗（Zymed 公司）；GRP78試劑盒及二抗（賽默飛世爾科技有限公司）。

2 方 法

2.1 動物分組及處理 將24 只SD 大鼠根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表分為常氧對照組、模型組、補(bǔ)陽還五湯組，每組8只。模型組與補(bǔ)陽還五湯組通過間歇低氧處理制備CIH模型［6］：每天9：00至17︰00，將大鼠放置在低氧艙中，低氧艙用KY-2F型控氧儀調(diào)控氧氣的濃度，達(dá)到后維持設(shè)定氧氣濃度（氧濃度下限為5.1%，上限21%）。每一個(gè)循環(huán)都分成4 個(gè)階段：下降期（50 s）、維持期（20 s）、上升期（30 s）、維持期（20 s），總共120 s，模擬中度OSAHS，其呼吸暫停低通氣指數(shù)（AHI）：30次/小時(shí)。常氧對照組：每天9:00至17:00將動物置于同等條件艙，頻率相同的間歇常氧（氧濃度為21%）處置，為期10周。造模第一天開始灌胃給藥，補(bǔ)陽還五湯組每天在低氧前、后0.5 h給予補(bǔ)陽還五湯灌胃，每次9.6 g/kg；常氧對照組與模型組給予等容積生理鹽水灌胃。期間均自由攝食及飲水，累計(jì)10周。

2.2 觀察指標(biāo)及方法 3 組大鼠取材前一晚禁食，測量體重后以10%的水合氯醛進(jìn)行腹腔麻醉后，取胰體以及胰尾，以0.9%生理鹽水洗去血液，置于EP管中，液氮中保存。

2.2.1 胰腺組織 GRP78、CHOP、Caspase-12 的蛋白表達(dá) 將胰腺行細(xì)胞沉淀，取其上清液，往上清液里加入2倍的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，加熱10 min蛋白變性后，冷卻，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，一抗孵育（1∶800 稀釋）及二抗孵育（1∶10 000 稀釋），利用ECL底物完成化學(xué)發(fā)光檢測后進(jìn)行定影。

2.2.2 胰腺細(xì)胞電鏡觀察 取出胰腺組織，4 ℃浸泡固定2 h（pH7.2），切成 1 mm×1 mm×3 mm 體積的組織塊后，使用 PBS（0.07 mol/L）、蔗糖緩沖液（0.19 mol/L）進(jìn)行清洗，再用鋨酸（1.0%）、PBS（0.24 mol/L）固定2 h，漂洗、乙醇脫水，浸泡過夜，次日依次進(jìn)行加溫聚合（37 ℃保持12 h、45 ℃保持12 h、60 ℃保持 12 h），再進(jìn)行超薄切片后，醋酸鈾與枸櫞酸鉛電子染色，最后Hitachi-7500 型透射電鏡行觀察及攝像。

2.2.3 血清空腹血糖（FBG）、糖化血清蛋白（GSP）、空腹胰島素（FINS）濃度的測定 采用日本京都血糖儀檢測FBG，余血以3 500 r/min離心10 min后分離血清，應(yīng)用果糖胺法測試GSP，酶聯(lián)免疫方法檢驗(yàn)FINS。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 各組大鼠血清FBG、GSP、FINS水平比較 見表1。

表1 各組大鼠血清FBG、GSP、FINS水平比較 （）

表1 各組大鼠血清FBG、GSP、FINS水平比較 （）

注：與常氧對照組比較，①P<0.05；與模型組比較，②P<0.05

組 別常氧對照組模型組補(bǔ)陽還五湯組n8 8 8 FBG（mmol/L）10.77±2.62 15.34±3.03①11.67±1.57②GSP（mmol/L）2.53±0.55 2.71±1.11 2.83±1.06 FINS（ng/ml）3.04±0.59 5.02±0.31①3.57±0.71②

表1 結(jié)果顯示，與常氧對照組比較，模型組FBG、FINS 水平明顯上升（P<0.05）；與模型組比較，補(bǔ)陽還五湯組FBG、FINS水平明顯下降（P<0.05）；而三組GSP水平無顯著性差異。

3.2 各組大鼠 GRP78、Caspase-12 和 CHOP 蛋白含量比較 見圖1、表2。

表2 各組大鼠GRP78、CHOP、Caspase-12蛋白表達(dá) （）

表2 各組大鼠GRP78、CHOP、Caspase-12蛋白表達(dá) （）

注：與常氧對照組比較，①P<0.05；與模型組比較，②P<0.05

組 別常氧對照組模型組補(bǔ)陽還五湯組n8 8 8 GRP78 0.12±0.02 0.91±0.04①0.14±0.02②CHOP 0.12±0.01 0.69±0.05①0.13±0.02②Caspase-12 0.12±0.01 0.79±0.07①0.13±0.01②

圖1 各組大鼠GRP78、CHOP、Caspase-12蛋白表達(dá)

Western blotting 檢測顯示：與常氧對照組比較，模型組GRP78、CHOP、Caspase-12 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，補(bǔ)陽還五湯組GRP78、CHOP、Caspase-12 表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），且與常氧對照組GRP78、CHOP、Caspase-12水平相當(dāng)，無明顯差異（P>0.05）。

3.3 各組大鼠胰腺細(xì)胞電鏡觀察結(jié)果 見圖2。

圖2 各組大鼠胰腺超微結(jié)構(gòu)

電鏡結(jié)果顯示：常氧對照組大鼠胰腺的細(xì)胞核膜完整，線粒體豐富整齊，線粒體嵴呈同心圓排列，密集清晰；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，清晰呈條索狀。模型組可見核膜不規(guī)則缺損，線粒體膜缺損，可見空泡變性的線粒體、伴有嵴距離擴(kuò)張及斷裂；同時(shí)出現(xiàn)擴(kuò)張的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，炎癥細(xì)胞浸潤。補(bǔ)陽還五湯組線粒體排列較整齊，與模型組相比空泡變性、腫脹、嵴擴(kuò)張減輕；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張、變形，排列較規(guī)律。

4 討 論

OSAHS 以夜間反復(fù)發(fā)生的低氧血癥和（或）呼吸暫停為主要特征，其與2 型糖尿病在臨床、流行病學(xué)和發(fā)病機(jī)制方面密切相關(guān)。而睡眠呼吸紊亂是引起胰島素抵抗的主要因素［7］。本研究結(jié)果表明，模型組空腹血糖、空腹胰島素水平均高于常氧對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示間歇低氧可引起胰島素抵抗、胰島β 細(xì)胞功能下降，其機(jī)制可能為夜間反復(fù)暫停呼吸會導(dǎo)致體內(nèi)缺氧以及高碳酸血癥，降低胰島素受體親和力；且反復(fù)低氧應(yīng)激反應(yīng)，可使得多種拮抗胰島素產(chǎn)物如兒茶酚胺、糖皮質(zhì)激素、胰高血糖素等增多，加重胰島素抵抗。OSAHS 由于慢性間歇低氧引起機(jī)體的病理生理變化，其中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)揮了很大的作用［8］。GRP78參與前體蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)及其折疊、組裝和運(yùn)輸，包括錯(cuò)誤折疊和組裝蛋白質(zhì)的輸出及相關(guān)降解，調(diào)節(jié)與ERS 相關(guān)的3 條主要信號通路（CHOP 信號通路、凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1-JNK 信號通路和Caspase-12信號通路），調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)穩(wěn)態(tài)的諸多生物學(xué)過程［9］。在正常生理狀態(tài)下，CHOP一般無法測到，它是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔的促凋亡分子，在ERS狀態(tài)下表達(dá)顯著增高，是ERS 的標(biāo)志［10］。Caspase-12 是介導(dǎo)ERS 誘發(fā)凋亡的關(guān)鍵分子，NAKAGAWA等［11］研究發(fā)現(xiàn)，Caspase-12 基因敲除細(xì)胞能抵抗ERS 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，而將激活的Caspase-12 導(dǎo)入細(xì)胞會促使細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示模型組的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子GRP78、CHOP、Caspase-12 蛋白表達(dá)均高于常氧對照組，說明間歇低氧會引起胰腺細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，從而導(dǎo)致胰腺細(xì)胞損傷。

中醫(yī)認(rèn)為阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征屬于“鼾癥”的范疇，是由痰濕內(nèi)阻、氣滯血瘀引起的，可根據(jù)患者臨床證候分為痰濕內(nèi)阻型、脾腎陽虛型、氣滯血瘀型等。補(bǔ)陽還五湯源自清代王清任的《醫(yī)林改錯(cuò)》，為益氣活血之代表方劑，由黃芪、當(dāng)歸尾、赤芍、地龍、川芎、紅花、桃仁組成，具有抗氧化作用，能減輕自由基代謝紊亂，具有補(bǔ)氣、活血、通絡(luò)之功效，在臨床上對于改善OSAHS 患者癥狀具有良好效果。本課題組前期臨床研究結(jié)果表明益氣祛痰中藥可明顯改善老年阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征患者的臨床癥狀、AHI指數(shù)、最低血氧飽和度（LSaO2）、氧化應(yīng)激反應(yīng)及炎癥反應(yīng)［12-13］。本研究結(jié)果表明，予補(bǔ)陽還五湯干預(yù)后胰腺細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激GRP78、CHOP、Caspase-12 蛋白表達(dá)均明顯降低，胰腺細(xì)胞結(jié)構(gòu)較模型組完整，提示該方可能通過下調(diào)胰腺GRP78、CHOP、Caspase-12 蛋白表達(dá)，來改善胰腺組織的細(xì)胞ERS的水平，從而保護(hù)胰島β細(xì)胞。