結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測(cè)在耐藥肺結(jié)核治療中的價(jià)值分析

陳澤蓮，張肇月，張美霞

（自貢市第一人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科 四川 自貢 643000）

肺結(jié)核是臨床常見(jiàn)病之一，而我國(guó)則是結(jié)核病的高負(fù)擔(dān)國(guó)家，據(jù)相關(guān)統(tǒng)計(jì)顯示，在全球肺結(jié)核患者中，我國(guó)占比約為1/4。在此病的治療中，藥物是主要治療手段，但在臨床藥物使用增加的同時(shí)，耐藥肺結(jié)核患者也隨之提高，想要進(jìn)一步確保耐藥肺結(jié)核的診斷準(zhǔn)確率，加大對(duì)檢測(cè)方法的研究就極為關(guān)鍵[1]。本文主要就結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測(cè)在耐藥肺結(jié)核治療中的應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行研究、分析，現(xiàn)報(bào)告如下。

1.資料與方法

1.1 一般資料

本次入選人員均選自2019 年6 月—2020 年6 月我院收治的涂陽(yáng)患者（80 例），采取數(shù)字法隨機(jī)分為對(duì)照組（40 例）和觀察組（40 例）。其中，對(duì)照組男22 例、女18 例，年齡27 ～76 歲；觀察組男24 例、女16 例，年齡28 ～76 歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者均符合肺結(jié)核臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，自愿參與此次研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他嚴(yán)重疾病、精神異常、資料不全者。在研究開(kāi)始前，患者及其家屬均提前知曉了有關(guān)內(nèi)容，并簽署了知情同意書(shū)。兩組一般資料比較差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），有可比性。

1.2 方法

在實(shí)際的治療中，應(yīng)用的藥物包括了乙胺丁醇、利福平、異煙肼。對(duì)照組實(shí)施常規(guī)藥敏試驗(yàn)，具體方法：使用K-B 試紙擴(kuò)散法，基于無(wú)菌前提下，結(jié)合NCCIS 試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)細(xì)菌的耐藥性進(jìn)行判斷、鑒定。觀察組實(shí)施結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測(cè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)熔解曲線(xiàn)法，具體方法：取患者的痰標(biāo)本，落實(shí)細(xì)菌培養(yǎng)，將病原菌分離，使用符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的試劑盒完成DNA 提取，基于設(shè)計(jì)好的引物前提下展開(kāi)PCR 擴(kuò)增，落實(shí)對(duì)DNA 單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析，電泳處理非變性聚丙烯酰胺凝膠孔，將溫度、電壓分別設(shè)定為4℃、130 ～150 v，經(jīng)4 ～5 小時(shí)后，將凝膠板取出，使用銀染法予以染色處理，將結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株h37Rv 作為對(duì)照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件完成所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)、分析，t、χ2分別用于計(jì)量、計(jì)數(shù)資料的檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 耐藥分析

通過(guò)相應(yīng)的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，觀察組檢出耐1 種藥物的有4 例，同時(shí)耐藥2 種藥物的有2 例，而對(duì)照組患者檢出1 種藥物耐藥的有5 例，同時(shí)耐2 種、3 種藥物的分別有3 例、1 例，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 兩組患者的耐藥情況對(duì)比[n（%）]

2.2 基因檢測(cè)

80 例患者中，利福平耐藥株有14 株，突變株數(shù)6 株；異煙肼耐藥株18 株，突變株數(shù)10 株；乙胺丁醇耐藥株16 株，突變株數(shù)8 株。三種耐藥基因突變率差異不明顯（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 兩組患者的基因檢測(cè)情況對(duì)比

3.討論

針對(duì)肺結(jié)核疾病而言，其屬于重大傳染性疾病，危險(xiǎn)性較高，嚴(yán)重影響著人們的健康及生活質(zhì)量。據(jù)相關(guān)報(bào)道指出，相較于發(fā)達(dá)國(guó)家，我國(guó)結(jié)核病的發(fā)生率、死亡率及病菌耐藥率均較高，每年因結(jié)核病死亡的人數(shù)高達(dá)13 萬(wàn)[2]。在此病的治療中，往往會(huì)使用抗菌藥物，如乙胺丁醇、利福平、異煙肼等，可達(dá)到對(duì)肺結(jié)核疾病發(fā)生及傳播遏制的目的。但值得注意的是，在病原菌耐藥性增加的同時(shí)，抗菌藥物抗感染效率也出現(xiàn)了一定的差異，故為進(jìn)一步確保治療效果，重視對(duì)藥物的細(xì)菌耐藥性判斷就顯得尤為重要，在治療方案中起著明顯的指導(dǎo)作用[3]。

有研究指出，結(jié)核分枝桿菌耐乙胺丁醇與embB 和306 位點(diǎn)的變異有關(guān)；耐異煙肼，與氧化氫酶-過(guò)氧化物酶的編碼基因KatG 基因缺失有一定關(guān)聯(lián)；耐利福平的產(chǎn)生，則與核心區(qū)域rpoB 基因圖片有一定關(guān)系。通過(guò)對(duì)結(jié)核病致病體的檢測(cè)以及耐藥性的分析，有利于為疾病的防治提供更加準(zhǔn)確的參考依據(jù)[4]。在基于治療次數(shù)和耐藥性關(guān)系的前提下來(lái)說(shuō)，認(rèn)為兩者呈正相關(guān)性，有臨床研究指出，相較于首次治療的患者，結(jié)核病二次復(fù)發(fā)接受治療的患者，其耐藥率相對(duì)較高。由此就可看出，落實(shí)對(duì)耐藥率的分析，可為臨床用藥提供指導(dǎo)。既往研究在對(duì)耐藥性進(jìn)行分析時(shí)，往往會(huì)忽略患者的診治次數(shù)，導(dǎo)致耐藥性分析不夠客觀，也影響了分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。近年來(lái)，對(duì)于治療次數(shù)和耐藥率方面的研究越來(lái)越多，發(fā)現(xiàn)初次診治失敗的患者行二次治療后，其耐藥率明顯較高，認(rèn)為與抗結(jié)核藥物的劑量有一定關(guān)系，從而就增強(qiáng)了結(jié)核分枝桿菌的耐藥性。因此，在對(duì)結(jié)核病患者進(jìn)行治療時(shí)，要確保選擇科學(xué)的治療方法，盡可能的縮短療程，重視疾病的復(fù)發(fā)，降低病菌耐藥性[5]。

在測(cè)定結(jié)核分枝桿菌耐藥性中，往往會(huì)采用比例法、濃度法等，但有學(xué)者指出，這些測(cè)定方法需要耗費(fèi)較長(zhǎng)的時(shí)間，一般在6 ～8 周，特殊情況下甚至更長(zhǎng)，這就難以確保治療的及時(shí)性[6]。近些年來(lái)，在分子生物技術(shù)不斷進(jìn)步的背景下，分枝桿菌耐利福平、耐異煙肼等相關(guān)基因被發(fā)現(xiàn)。有研究指出，在檢測(cè)rpsL、KatG 等基因圖片檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，rpsL、KatG 等基因突變率較高，高達(dá)90%，本文中相關(guān)藥物耐藥株基因也較高，這與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道相符[7]。由此就可看出，在耐藥基因檢測(cè)中，熒光PCR 熔解曲線(xiàn)法的優(yōu)勢(shì)明顯，主要體現(xiàn)于靈敏性高、特異性高等方面，但值得注意的是，此方法雖然具有較高的應(yīng)用價(jià)值，但實(shí)際操作中仍存在一些亟需解決的問(wèn)題，即操作較為繁瑣，極有可能出現(xiàn)交叉感染現(xiàn)象等。有研究指出，在基因檢測(cè)中，LAMP 法、熒光PCR 熔解曲線(xiàn)法均具備較高的特異性及靈敏性，無(wú)需應(yīng)用特殊試劑及預(yù)先行雙鏈DNA 變性，其中熒光PCR 熔解曲線(xiàn)法優(yōu)勢(shì)主要體現(xiàn)于快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確等方面。值得注意的是，熒光PCR 熔解曲線(xiàn)法需要應(yīng)用特殊的儀器，且對(duì)試驗(yàn)環(huán)境以及試劑提出了較高的要求。另有研究指出，在耐藥結(jié)核分枝桿菌菌株突變方面，熒光PCR 熔解曲線(xiàn)可提供幫助，對(duì)于一線(xiàn)、二線(xiàn)抗結(jié)核藥物的耐藥性可同時(shí)檢測(cè)出，這就直接規(guī)避了表型藥物敏感實(shí)驗(yàn)的不足，可快速獲取檢測(cè)結(jié)果。通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，對(duì)于耐多藥 結(jié)核分枝桿菌菌株而言，其在EMB、SM 表型耐藥中的穩(wěn)定性不強(qiáng)，與表型檢測(cè)試驗(yàn)相比，熒光PCR 溶解曲線(xiàn)法的應(yīng)用價(jià)值更高。但是，此方法往往也會(huì)受到一定局限，即受方法篩選無(wú)氨基酸序列的影響，就極易導(dǎo)致氨基酸改變的突變，從而被判定為突變型。另外，如若檢測(cè)樣品的耐藥菌株不均一，菌株比例過(guò)于偏低，就可能被判定為敏感型，引發(fā)假陰性問(wèn)題。

綜上所述，結(jié)核病是較為常見(jiàn)的一種慢性傳染疾病，發(fā)病機(jī)制為結(jié)核分枝桿菌感染，藥物是主要治療手段，常用的有乙胺丁醇、異煙肼等，能夠控制患者病情的發(fā)展，減少死亡率。因此，在肺結(jié)核的治療中，就需落實(shí)對(duì)結(jié)核分枝桿菌耐藥性的檢測(cè)及分析，合理的選用檢測(cè)技術(shù)，以確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，從而為患者的診治提供參考，這也是避免患者錯(cuò)過(guò)最佳治療時(shí)機(jī)的關(guān)鍵，應(yīng)引起重視。