血必凈注射液對(duì)膿毒癥患者血小板活化因子CD62P和CD63的影響*

溫軍祥，陳紅芬，史有奎，李來(lái)傳，陳京霞

（1.濰坊醫(yī)學(xué)院，山東 濰坊261000；2.濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 急診科，山東 濰坊261000）

膿毒癥是指由感染引起的宿主反應(yīng)失調(diào)導(dǎo)致的危及生命的器官功能障礙[1]。大多數(shù)膿毒癥患者是由感染、創(chuàng)傷、手術(shù)、燒傷等因素引起，其并發(fā)癥包括嚴(yán)重膿毒癥、膿毒性休克、多器官功能障礙等，是目前急危重醫(yī)學(xué)科所面臨的重要難題之一[2]。近幾年對(duì)膿毒癥的認(rèn)識(shí)不斷加深，醫(yī)學(xué)治療手段也不斷提高，重癥醫(yī)學(xué)科的技術(shù)發(fā)展尤為快速。每年全球大約仍有1 900 萬(wàn)的膿毒癥患者，約25%的膿毒癥患者死亡，其病死率居高不下，而在存活的患者中，仍有大約300 萬(wàn)患者存在認(rèn)知功能障礙[1]。所以，對(duì)于膿毒癥的研究不能止于當(dāng)下。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)[3-5]，凝血系統(tǒng)活化和促炎反應(yīng)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)與膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，相互促進(jìn)，血小板激活參與其中并起著橋梁作用。近年來(lái)研究熱點(diǎn)是通過(guò)探討血小板活化的機(jī)制及血小板活化功能的檢測(cè)方法來(lái)發(fā)現(xiàn)治療膿毒癥的新策略。檢索時(shí)間截至2019年12月15 日，共檢索到血必凈注射液對(duì)于膿毒癥患者的治療具有臨床效果的文章472 篇，且全部文獻(xiàn)質(zhì)量的Jadad 評(píng)分均≥3 分，說(shuō)明在我國(guó)血必凈注射液已被廣泛應(yīng)用于膿毒癥的治療。關(guān)于血必凈注射液治療膿毒癥作用機(jī)制的研究主要集中在抑制炎癥因子的合成與釋放，糾正凝血功能紊亂及改善機(jī)體免疫力等方面，關(guān)于其對(duì)血小板活化功能影響方面的研究很少。本研究旨在通過(guò)檢測(cè)接受血必凈注射液治療膿毒癥患者的血小板活化相關(guān)因子CD62P 和CD63 的陽(yáng)性表達(dá)率，探討血必凈注射液對(duì)膿毒癥患者血小板活化水平的影響，進(jìn)而探討血必凈注射液對(duì)膿毒癥患者的作用機(jī)制，為血必凈注射液在膿毒癥中的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年6月—2020年1月濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院搶救監(jiān)護(hù)室（EICU）、重癥監(jiān)護(hù)治療病房（ICU）收治的42 例膿毒癥患者。按照入院時(shí)間順序?qū)⒒颊呔幪?hào)為1～42 號(hào)，選取隨機(jī)數(shù)字列表（第22 列前42 位隨機(jī)數(shù)字），奇數(shù)為常規(guī)治療組，偶數(shù)為血必凈組，其中常規(guī)治療組22 例，血必凈組20 例。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：按照中國(guó)膿毒癥/膿毒性休克急診治療指南2018[1]為標(biāo)準(zhǔn)，選取濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院EICU、ICU 的膿毒癥患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①＜18 周歲；②妊娠、哺乳；③凝血性疾病史；④入院前2 周應(yīng)用影響血小板功能的藥物或抗凝血藥物；⑤非膿毒癥引起的血小板減少，如惡性腫瘤、嚴(yán)重肝腎疾??；⑥入院48 h 內(nèi)死亡的患者；⑦拒絕參加臨床試驗(yàn)及失聯(lián)的患者。

1.3 方法

1.3.1 治療方法常規(guī)治療組的主要治療措施包括抗感染、臟器保護(hù)及對(duì)癥支持治療，不使用凝血抑制藥物和抗凝血藥物，包括普通肝素和低分子肝素。血必凈組在常規(guī)治療組的治療措施基礎(chǔ)上給予血必凈注射液（天津紅日藥業(yè)股份有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：1901311）100 ml+100 ml 生理鹽水靜脈滴注，2 次/d，連續(xù)7 d，治療過(guò)程中血必凈注射液在給藥前后應(yīng)用50～100 ml 生理鹽水沖管。

1.3.2 治療評(píng)價(jià)與數(shù)據(jù)收集患者分別于入院后第1 天，第8 天抽全血3 ml，3 000 r/min 離心10 min，取上清液，放置于-20℃冰箱冷凍保存，操作前常溫下復(fù)溫。用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)CD62P、CD63 的陽(yáng)性表達(dá)率（試劑盒購(gòu)自上海拜力生物科技有限公司，F(xiàn)ACSVerse 流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD 公司），檢測(cè)白細(xì)胞（WBC）、中性粒細(xì)胞比例（NEUT%）、血小板計(jì)數(shù)、C 反應(yīng)蛋白（CRP）、降鈣素原（PCT）、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、總膽紅素（TBIL）、直接膽紅素（DBIL）、血尿素氮（BUN）、凝血酶原時(shí)間（PT）、激活部分凝血酶原時(shí)間（APTT）、D-二聚體（D-Dimer）及纖維蛋白原（FIB）水平，腎小球?yàn)V過(guò)率（GFR）由MDRD 公式計(jì)算獲得。以上同時(shí)期的標(biāo)本均由同一取樣人在同一時(shí)間內(nèi)，在患者的同一部位進(jìn)行采集。分別于入院后第1 天（24 h 內(nèi)）和第8 天進(jìn)行序貫器官衰竭評(píng)分（SOFA）和急性生理學(xué)及慢性健康狀況評(píng)分系統(tǒng)（APACHE Ⅱ）評(píng)分。血必凈組患者的評(píng)分必須在輸注血必凈注射液之前進(jìn)行。記錄患者的14 d 全因死亡率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以構(gòu)成比或率（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析用Spearman 法；影響因素的分析用多因素Logistic 逐步回歸模型。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者一般臨床特征比較

兩組患者的性別構(gòu)成、高血壓、糖尿病、心腦血管病、腎病、感染部位、年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），住院時(shí)間及死亡例數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 兩組患者一般臨床特征比較

2.2 兩組患者入院第1天臨床資料及評(píng)分比較

兩組患者入院第1 天的WBC、NEUT%、CRP、PCT、血小板計(jì)數(shù)、PT、APTT、D-Dimer、FIB、AST、ALT、TBIL、DBIL、BUN 及GFR 水平，SOFA 評(píng)分 和APACHE Ⅱ評(píng)分，CD62P 和CD63 的陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 兩組患者入院第1天臨床資料及評(píng)分比較 （±s）

表2 兩組患者入院第1天臨床資料及評(píng)分比較 （±s）

組別常規(guī)治療組血必凈組t 值P 值n 22 20 WBC/（×1012/L）12.20±3.57 12.13±6.87 0.043 0.969 NEUT/%79.14±13.32 84.06±6.05-1.564 0.128血小板計(jì)數(shù)/（×109/L）114.55±45.47 125.55±43.36-1.310 0.198 CRP/（mg/L）85.13±80.08 72.44±77.60 0.520 0.606 PCT/（μg/L）2.69±3.78 3.01±4.54-0.252 0.803組別常規(guī)治療組血必凈組t 值P 值PT/s 16.45±4.68 15.13±3.19 1.052 0.299 APTT/s 31.64±8.27 32.95±6.40-0.568 0.573 D-Dimer/（mg/L）0.96±0.88 1.49±1.63-1.295 0.206 FIB/（g/L）4.18±1.47 3.43±0.89 2.001 0.053 ALT/（u/L）82.34±67.94 121.53±257.87-0.659 0.517 AST/（u/L）77.23±59.02 197.25±447.44-1.190 0.248 TBIL/（μmol/L）16.45±13.09 27.24±52.49-0.934 0.356組別常規(guī)治療組血必凈組t 值P 值DBIL/（μmol/L）7.83±7.94 16.94±42.06-0.998 0.324 BUN/（mmol/L）11.51±12.55 9.58±10.01 0.547 0.588 GFR/（ml/min）82.11±30.52 91.10±35.86-0.877 0.386 SOFA評(píng)分3.82±1.37 4.25±2.00-0.824 0.415 APACHEⅡ評(píng)分13.68±1.64 14.00±2.60-0.479 0.634 CD62P/%2.36±0.43 2.54±0.62-1.128 0.266 CD63/%1.47±0.57 1.28±0.64 1.025 0.312

2.3 兩組患者治療第8天臨床資料及評(píng)分比較

兩組患者治療第8 天的NEUT%、血小板計(jì)數(shù)、PCT、PT、APTT 及FIB 水平，SOFA 評(píng)分和APACHE Ⅱ評(píng)分，CD62P 和CD63 的陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其中，血必凈組血小板計(jì)數(shù)較常規(guī)治療組升高。見(jiàn)表3。

表3 兩組患者治療第8天臨床資料及評(píng)分比較 （±s）

表3 兩組患者治療第8天臨床資料及評(píng)分比較 （±s）

組別常規(guī)治療組血必凈組t 值P 值n 22 20 WBC/（×1012/L）8.82±3.24 7.45±2.76 1.483 0.146 NEUT/%77.39±9.67 68.02±11.53 2.864 0.007血小板計(jì)數(shù)/(×109/L）98.55±22.60 281.85±62.79-12.349 0.000 CRP/（mg/L）15.30±11.14 40.81±62.89-1.789 0.089 PCT/（μg/L）1.22±1.87 0.23±0.23 2.455 0.023組別常規(guī)治療組血必凈組t 值P 值PT/s 18.87±3.90 13.12±2.16 5.830 0.000 APTT/s 32.89±5.05 24.48±3.79 6.050 0.000 D-Dimer/（mg/L）1.56±2.14 0.60±0.43 1.969 0.056 FIB/（g/L）4.05±1.35 3.03±1.15 2.632 0.012 ALT/（u/L）40.04±16.50 65.27±127.55-0.378 0.391 AST/（u/L）33.12±9.34 71.71±166.22-1.037 0.313 TBIL/（μmol/L）12.43±4.59 22.79±56.31-0.861 0.394組別常規(guī)治療組血必凈組t 值P 值DBIL/（μmol/L）5.77±2.94 14.24±44.78-0.887 0.381 BUN/（mmol/L）9.83±10.02 10.12±14.18-0.075 0.941 GFR/（ml/min）95.29±26.91 103.88±36.88 0.141 0.888 SOFA評(píng)分4.86±1.91 1.90±1.65 5.354 0.000 APACHE Ⅱ評(píng)分13.32±3.67 5.75±2.45 7.780 0.000 CD62P/%1.98±0.48 1.02±0.36 7.250 0.000 CD63/%1.86±0.76 0.77±0.27 6.074 0.000

2.4 CD62P、CD63與血小板計(jì)數(shù)、NEUT%、PCT、FIB、PT、APTT、SOFA 評(píng)分、APACHE Ⅱ評(píng)分的相關(guān)性

Spearman 相關(guān)分析顯示，CD62P 陽(yáng)性表達(dá)與血小板計(jì)數(shù)呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），與NEUT%、PT、APTT、SOFA 評(píng)分、APACHE Ⅱ評(píng)分呈正相關(guān)（P＜0.05）；CD63 陽(yáng)性表達(dá)與血小板計(jì)數(shù)呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），與NEUT%、PCT、PT、APTT、SOFA 評(píng)分和APACHE II 評(píng)分呈正相關(guān)（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

表4 CD62P、CD63與血小板計(jì)數(shù)、NEUT%、PT、APTT、FIB、SOFA評(píng)分、APACHE Ⅱ評(píng)分的相關(guān)性

2.5 膿毒癥患者14 d全因死亡的危險(xiǎn)因素

采用多因素Logistic 逐步回歸分析膿毒癥患者14 d 全因死亡的危險(xiǎn)因素，調(diào)整混雜因素后，以死亡為因變量（1 =存活，0 =死亡），以血小板計(jì)數(shù)、PT、APTT、SOFA 評(píng)分、APACHE Ⅱ評(píng)分、CD62P 陽(yáng)性表達(dá)、CD63 陽(yáng)性表達(dá)為自變量，α入=0.05，α出=0.10，結(jié)果：CD62P 陽(yáng)性表達(dá)[O^R=0.250（95% CI：0.102，0.608）]和CD63 陽(yáng)性表達(dá)[O^R=0.108（95% CI：0.024，0.491）]為膿毒癥患者死亡的危險(xiǎn)因素（P＜0.05），血小板計(jì)數(shù)[O^R =1.014（95% CI：1.000，1.027）]為膿毒癥患者死亡的保護(hù)因素（P＜0.05）。見(jiàn)表5。

表5 膿毒癥患者14 d全因死亡的多因素Logistic回歸分析相關(guān)參數(shù)

3 討論

膿毒癥是內(nèi)科的急危重癥之一，其發(fā)病趨勢(shì)近年來(lái)呈上升趨勢(shì)[6]。目前對(duì)于膿毒癥的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，其中包括炎癥反應(yīng)機(jī)制、免疫功能紊亂機(jī)制、凝血功能紊亂機(jī)制、腸道細(xì)菌移位機(jī)制以及基因多態(tài)性機(jī)制等等[7]。在膿毒癥發(fā)病早期，凝血系統(tǒng)的激活，纖溶系統(tǒng)的抑制一起參與到疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中。血小板是由成熟的巨核細(xì)胞產(chǎn)生，血小板除了參與凝血和血栓的形成之外，還參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)[8]。

血小板活化相關(guān)因子包括特異性血小板標(biāo)志物膜糖蛋白CD62P 和CD63、PAC-1、泛血小板標(biāo)記物CD41、CD61 以及E-選擇素；本研究只探討血必凈注射液對(duì)CD62P、CD63 的活化作用的影響及作用機(jī)制。CD62P 是位于血小板膜上的糖蛋白，又叫P-選擇素，當(dāng)血小板處于靜止?fàn)顟B(tài)時(shí)，CD62P 很少表達(dá)或基本上不表達(dá)，如果一旦被凝血系統(tǒng)激活或被活化，血小板內(nèi)的α 顆粒和細(xì)胞質(zhì)膜則會(huì)快速融合，致使平均每個(gè)血小板質(zhì)膜上大約有1000 個(gè)CD62P 分子同時(shí)表達(dá)，同時(shí)介導(dǎo)血小板在內(nèi)皮細(xì)胞上粘附、釋放、聚集等，因此，CD62P 在血小板質(zhì)膜上的表達(dá)或陽(yáng)性百分率的增加已經(jīng)被廣泛認(rèn)為是血小板活化的特異性標(biāo)志物[9]。國(guó)內(nèi)也有文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，血小板參與血栓形成的過(guò)程也是通過(guò)血小板表面的膜糖蛋白的功能實(shí)現(xiàn)的[10]。CD63 是血小板內(nèi)溶酶體顆粒膜蛋白，在靜息狀態(tài)下也只有極少量表達(dá)，而當(dāng)血小板處于活化狀態(tài)時(shí)，CD63 可以隨著脫顆粒反應(yīng)而在血小板表面大量表達(dá)，同時(shí)介導(dǎo)中性粒細(xì)胞對(duì)活化內(nèi)皮的粘附，因此，CD63 也可以作為血小板活化的理想標(biāo)志物[11]。本研究結(jié)果顯示，治療后常規(guī)治療組的CD62P、CD63的陽(yáng)性表達(dá)率高于血必凈組，血小板計(jì)數(shù)低于血必凈組；血小板活化因子CD62P、CD63 與血小板計(jì)數(shù)呈負(fù)相關(guān)，與SOFA 評(píng)分、APACHE Ⅱ評(píng)分、PT、APTT 均呈正相關(guān)。之前已有文獻(xiàn)表明，SOFA 評(píng)分、APACHE Ⅱ評(píng)分可以作為膿毒癥患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[12]，也有文獻(xiàn)表明，膿毒癥患者早期血小板計(jì)數(shù)下降對(duì)預(yù)測(cè)多器官功能障礙、死亡有重要的價(jià)值，并且血小板計(jì)數(shù)下降是膿毒癥患者器官功能障礙的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[13]。CD62P、CD63 是來(lái)源于血小板表面的活化因子，與SOFA 評(píng)分、APACHE Ⅱ評(píng)分呈正相關(guān)，與血小板計(jì)數(shù)呈負(fù)相關(guān)，因此，CD62P、CD63 的陽(yáng)性表達(dá)率可以作為預(yù)測(cè)膿毒癥患者多器官功能衰竭、死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。本研究通過(guò)多因素Logistic 回歸分析發(fā)現(xiàn)，CD62P 和CD63 陽(yáng)性表達(dá)是膿毒癥患者14 d 死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而血小板計(jì)數(shù)是膿毒癥患者14 d 死亡的獨(dú)立保護(hù)因素，與上述文獻(xiàn)結(jié)論相一致。所以，CD62P、CD63 可以作為膿毒癥患者早期預(yù)后的監(jiān)測(cè)指標(biāo)。

從分子機(jī)制來(lái)講，血必凈注射液的主要成分有紅花、赤芍、川芎、丹參、當(dāng)歸，其中有效成份包括阿魏酸、紅花黃色素A、川芎嗪、丹參素、原兒茶醛以及赤芍總苷等?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究已經(jīng)表明，川芎嗪主要通過(guò)增加血小板和血漿內(nèi)cAMP 水平，阻斷了血小板的活化，同時(shí)激活了纖溶酶原，降低血小板表面的活性，抑制血小板的粘附、聚集、活化，從而降低血液粘度，達(dá)到改善微循環(huán)作用，還有就是通過(guò)降低血管的通透性，保護(hù)缺血-再灌注損傷，增強(qiáng)內(nèi)皮祖細(xì)胞修復(fù)血管內(nèi)膜的作用，調(diào)節(jié)血管舒縮功能[14]。阿魏酸主要通過(guò)抑制5-羥色胺的釋放，抑制血栓素烷A2 的生物活作用性，增加前列環(huán)素活性，使得PT、TT、APTT 延長(zhǎng)[15]。紅花黃色素A 屬于黃酮類(lèi)化合物中查爾酮類(lèi)，通過(guò)電壓門(mén)控通道和受體門(mén)控通道兩個(gè)通道抑制了細(xì)胞外Ca2+的內(nèi)流，進(jìn)而抑制KCl 及苯腎上腺素對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞及去內(nèi)皮血管環(huán)的收縮用，擴(kuò)張微動(dòng)脈，達(dá)到改善微循環(huán)的作用[16]。原兒茶醛，化學(xué)名為3'4-二羥基苯甲醛，是丹參水溶性成分丹酚酸B 降解的主要產(chǎn)物之一，通過(guò)抑制5-HT 釋放及抑制前列腺素代謝系統(tǒng)環(huán)氧化酶的活性，進(jìn)而抑制血小板的活化作用[17]。赤芍總苷是由芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、氧化芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、芍藥花苷等單萜苷類(lèi)化合物構(gòu)成，通過(guò)改善血液黏稠度、降低血小板活化因子的表達(dá)及保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷等機(jī)制，對(duì)抗血栓形成[18]。因此，血必凈注射液通過(guò)對(duì)血小板活化因子CD62P、CD63 的抑制來(lái)降低膿毒癥患者的病死率，血必凈注射液對(duì)膿毒癥患者的預(yù)后有改善作用。

綜上所述，血必凈注射液可能通過(guò)抑制膿毒癥患者血小板活化因子CD62P、CD63 的陽(yáng)性表達(dá)率，降低血小板活化水平，降低膿毒癥患者的14 d 全因死亡率，改善其近期預(yù)后。本研究為小樣本的單中心研究，結(jié)果有一定局限性，下一步希望開(kāi)展大樣本的、多中心的臨床研究。