香菇柄多糖的提取純化及抗氧化活性研究

陳 平 江崇弘

（1、南陽理工學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，河南 南陽473000 2、河南省工業(yè)微生物資源與發(fā)酵技術(shù)重點實驗室，河南 南陽 473000）

香菇為真菌植物門真菌香蕈的子實體，屬擔(dān)子菌綱傘菌科，是世界上著名的食用菌之一，且具有較高的藥用價值[1]。香菇多糖為香菇提取物中最重要的活性成分之一，在調(diào)控機體免疫，抗腫瘤、抗病毒、抗炎、抗氧化等方面的作用顯著[2-4]，相關(guān)研究受到越來越多人的關(guān)注。有研究指出香菇多糖的分子量和純度與其功能密切相關(guān)。香菇多糖本身為一種復(fù)雜的生物大分子，大大增加了其提取純化的難度，進而限制了香菇多糖功效的發(fā)揮、構(gòu)效關(guān)系以及作用機制的研究。目前用于香菇多糖提取的方法主要有熱水浸提、酸提法、酶提法、微波輔助法、超聲輔助法等[5]，這些方法所得多糖多為粗多糖。香菇柄是香菇采收過程中的副產(chǎn)物，產(chǎn)量大，價格便宜，主要用于加工生產(chǎn)香菇醬、飼料等低附加值產(chǎn)品，鑒于香菇柄中的營養(yǎng)成分近似于香菇傘，且多糖亦為其主要活性成分，故對香菇柄進行深加工和綜合利用具有重要的現(xiàn)實意義[6]。本文以香菇柄為原料，利用水溶液浸提法提取香菇柄中的多糖后，聯(lián)合柱層析法對提取的粗多糖進純化，并就純化所得多糖的抗氧化活性進行初步研究，以期為香菇柄中多糖的開發(fā)利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

1 實驗材料與方法

1.1 材料。香菇，購自市內(nèi)萬德隆超市。

1.2 主要試劑。濃硫酸、苯酚、無水乙醇、過硫酸鉀、氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、鹽酸、碳酸氫鈉等試劑均為分析純。G-150 葡聚糖凝膠：上海伊卡生物科技有限公司；DEAE——52 纖維素和DPPH：福州飛凈生物科技有限公司；ABTS/ABTS 底物：上海士鋒生物科技有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備。小型粉碎機：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱、電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海申順生物科技有限公司；紫外可見光分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；低速離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠；恒流泵層析柱：上海夏美生化發(fā)展有限公司。

1.4 實驗方法。1.4.1 香菇柄多糖的提取。購買的香菇取柄，用清水洗凈表面的泥土，撕碎，在45℃下進行低溫烘干，粉碎，過40 目篩，稱取適量置于500mL 圓底燒瓶中，按照1:40（香菇柄：水）質(zhì)量體積比加入蒸餾水混勻后放入水浴鍋中，在85℃的條件下浸提3h，抽濾后得濾液，對所得濾液進行減壓濃縮至一定體積后，加入適量無水乙醇，使樣品中無水乙醇濃度至90%，攪拌均勻后，4℃過夜，取出樣品離心收集沉淀，并用無水乙醇洗滌絮凝物沉淀3 次，將所得絮凝物在60℃真空干燥烘干至恒重得香菇柄粗多糖。1.4.2 香菇柄多糖含量的測定。多糖含量測定采用苯酚硫酸法，具體步驟參考文獻[7]。1.4.3 香菇柄多糖的純化。1.4.3.1 香菇柄多糖DEAE-52 纖維素離子交換層析對于粗多糖初步純化采用DEAE-52 纖維素離子交換層析，具體實驗步驟參考文獻[8]。準(zhǔn)確稱取熱水提取法得到的粗多糖50mg 加5mL 蒸餾水溶解，4000r/min 離心10min，制成10mg/mL的多糖溶液，過0.45μm 濾膜后上樣，依次用蒸餾水、0.2mol/mL、0.4mol/mL NaCl，以1mL/min的洗脫速度洗脫，洗脫體積約100mL，收集洗脫液。并用苯酚硫酸法測其在490nm 波長下的吸光值，根據(jù)吸光值繪制洗脫曲線。1.4.3.2 香菇柄多糖葡聚糖凝膠過濾層析。為得到均一性多糖，將離子交換層析純化所得多糖采用G-150 凝膠過濾層析進一步純化，具體實驗步驟參考文獻[9]。準(zhǔn)確稱取經(jīng)離子交換層析初步純化得到的多糖20mg 加2mL 蒸餾水溶解，4000 r/min 離心10min，制成10mg/mL的多糖溶液，0.45μm 濾膜過濾后上樣。用蒸餾水進行洗脫，洗脫速度為0.2mL/min，收集洗脫液并用苯酚硫酸法測其在490nm 波長下的吸光值，根據(jù)吸光值繪制洗脫曲線，收集主要組分濃縮到原來體積的1/4。用蒸餾水透析24h，干燥至恒重后用于后續(xù)活性分析。1.4.4 香菇柄多糖抗氧化活性的測定。1.4.4.1 香菇柄多糖DPPH 自由基清除實驗[10]。準(zhǔn)確稱取純化制備的香菇柄多糖用蒸餾水配制濃度分別為0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1.0mg/mL的多糖溶液待測，取3mL 多糖待測液與3mL 濃度為0.08mg/mL的DPPH 溶液混勻，放置2min，用無水乙醇做空白對照，測其517nm 下的吸光值（A1）；3mL 蒸餾水與3mLDPPH 所測吸光值為A2；3mL 多糖待測液與3mL 蒸餾水所測吸光值為A3；根據(jù)公式DPPH 自由基清除率=[1-(A3-A1)/A2]*100%計算香菇柄多糖的DPPH 清除率。1.4.4.2 香菇柄多糖ABTS 自由基抑制實驗[11]。取3mL 多糖待測液與5mLABTS 工作液搖勻，放置5min，用蒸餾水做空白對照，測其734nm 下的吸光值（A1′）；3mL 蒸餾水與5mL ABTS 工作液所測吸光值為A2′；3mL 蒸餾水與5mL 蒸餾水所測吸光值為A3′；根據(jù)公式抑制率=[1-(A3′-A1′)/A2′]*100%計算ABTS 自由基抑制率。

2 結(jié)果與分析

2.1 香菇柄多糖的提取結(jié)果。采用熱水提取對香菇柄中粗多糖進行提取后按照1:4的體積比加入無水乙醇對粗多糖濃縮液進行醇沉，可得到0.43g 多糖，得率為4.3%，即43mg/g。

2.2 香菇柄多糖的純化結(jié)果。2.2.1 DEAE-52 纖維素離子交換層析結(jié)果。將DEAE-52 纖維素離子交換層析收集到的各管洗脫液，在490nm 波長下測其吸光值，以洗脫液體積為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制洗脫曲線如圖1 所示。可見經(jīng)過不同的洗脫液洗脫后，可得到一個明顯的峰。收集該峰對應(yīng)的洗脫液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至收集液原始體積的1/4 后醇沉后離心取下層沉淀，將沉淀干燥即得到經(jīng)DEAE-52 纖維素純化得到的多糖，稱重得其質(zhì)量為35mg，計算粗多糖經(jīng)初步純化得率為70%，即香菇柄多糖得率3.01%。2.2.2 G-150 葡聚糖凝膠層析結(jié)果。將G-150 葡聚糖凝膠層析收集到的各管洗脫液在490nm 波長下測其吸光值并繪制洗脫曲線，結(jié)果如圖2 所示，經(jīng)洗脫可得到一個明顯的峰，收集該峰對應(yīng)的洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至收集液原始體積的1/4 后醇沉干燥即得到經(jīng)凝膠過濾層析純化得到的多糖，稱重得其質(zhì)量為15mg，計算初步純化的多糖經(jīng)二次純化后得率為75%。聯(lián)合使用DEAE-52 纖維素離子交換層析和G-150 凝膠過濾層析對粗多糖進行純化結(jié)果可知每50mg 粗多糖純化后可獲得26.25mg的純多糖，最終多糖的純化得率為52.5%，即香菇柄多糖得率為2.26%。

圖1 DEAE-52 纖維素離子交換層析洗脫曲線

圖2 G-150 凝膠過濾層析洗脫曲線

2.3 香菇柄多糖抗氧化活性測定結(jié)果。2.3.1 香菇柄多糖對DPPH 自由基的清除效果。將純化所得多糖分別配制成濃度為0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1.0mg/mL的 多 糖 溶液，測得的DPPH 自由基清除率如圖3 所示，由圖可知香菇柄多糖DPPH 自由基清除率同陽性對照Vc 一樣均隨著待測樣本濃度的增加而逐漸增大，說明該多糖與DPPH的清除率存在較好的量效關(guān)系。其中香菇柄多糖的DPPH 自由基清除能力由0.2mg/mL的23.21%增加至濃度為1mg/mL的39.24%。2.3.2 香菇柄多糖對ABTS 自由基的清除效果。香菇柄多糖對ABTS 自由基的清除效果如圖4 所示，由圖可知香菇柄多糖ABTS 自由基清除率同陽性對照Vc 一樣均隨著待測樣本濃度的增加而逐漸增大，其中香菇柄多糖的ABTS 自由基清除能力由19.25%增加至33.45%。結(jié)合兩者之間清除率的具體數(shù)據(jù)可知雖然香菇柄中的多糖對DPPH的清除能力與Vc 存在一定差距，但仍表現(xiàn)出一定的抗氧化活性。

圖3 香菇柄多糖對DPPH 自由基的清除能力

圖4 香菇柄多糖對ABTS+自由基的清除能力

3 結(jié)論

利用熱水提取法和柱層析法對香菇中多糖進行提取純化，并對所得多糖的活性進行初步探索，最終香菇柄多糖得率可達(dá)2.26%。文中香菇柄多糖的提取純化方法和數(shù)據(jù)為相關(guān)多糖的制備提供了參考。由于多糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，純化所得多糖的具體結(jié)構(gòu)的解析是后續(xù)的研究方向之一。另外純化后的多糖表現(xiàn)出一定的DPPH 自由基和ABTS 自由基清除能力，且兩種自由基的清除效果與多糖濃度成較好的線性關(guān)系，可進一步從生化、細(xì)胞、動物多層次多水平綜合判斷建立香菇柄多糖抗氧化活性與結(jié)構(gòu)和量之間的關(guān)系，進而為香菇柄多糖的相關(guān)研究提供指導(dǎo)，為高附加值香菇產(chǎn)品的獲得提供支持。