EphA2受體及其配體EphrinA1在乳腺癌中的表達及意義

陳波,李莊,張本斯(.湖南師范大學(xué)附屬湘東醫(yī)院,湖南 株洲 400;.大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院,云南 大理 67000;.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,云南 大理 67000）

近年來，隨著分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)、生物技術(shù)等學(xué)科的發(fā)展，我國在對乳腺癌的臨床研究上取得了巨大的發(fā)展，對乳腺癌生物學(xué)標(biāo)志物的研究達幾十種之多，并且還在不斷增加，如ER、PR、HER-2、CD44、P53、Ki67、muc-1、mdrl等，其中研究較為深入的為HER-2、ER、PR，并且在對乳腺癌的治療及預(yù)后評價中應(yīng)用最多。但是其特異性以及敏感性仍然不夠理想，所以，尋找一個對乳腺癌更具有特異性及敏感性的分子標(biāo)志物顯得尤為迫切。

表l EphA2蛋白在乳腺癌中的表達與臨床病理因素的關(guān)系

而近年來Eph（erythropoitin producing hepatocellular carcinoma）受體家族被發(fā)現(xiàn)與多種惡性腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移及血管生成相關(guān)，可作為潛在的腫瘤分子標(biāo)志物及治療靶點[1-4]。在乳腺癌中，Eph/ephrin信號同樣具有促進腫瘤進展和血管生成、調(diào)節(jié)腫瘤干細胞穩(wěn)態(tài)、抑制腫瘤發(fā)展等多面作用，且Eph/ephrin表達譜與乳腺癌患者的臨床結(jié)果相關(guān)[5-7]。

本研究主要通過免疫組化的方法來檢測乳腺癌中EphA2受體及配體EphrinA1的表達情況。并且通過統(tǒng)計學(xué)方法來探討乳腺癌中EphA2受體及其配體EphrinA1的表達與臨床病理因素的關(guān)系，以期對乳腺癌的治療和預(yù)后提供一個新的思路。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 臨床資料和組織樣本 選取云南省大理大學(xué)附屬醫(yī)院93例術(shù)前未行放療、化療或其他特殊治療的各民族女性乳腺癌手術(shù)切除標(biāo)本及病人的臨床病例信息。所選患者的臨床資料包括年齡、腫瘤大小、病理類型、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和組織學(xué)分級等。所取腫瘤標(biāo)本的病理類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和組織學(xué)分級等病理參數(shù)均來自于病理報告。

1.1.2 主要試劑與儀器 EphA2兔/羊抗人多克隆抗體（adcam公司），EphrinA1兔抗人多克隆抗體（invitrogen公司），SP免疫組化試劑盒（SP9710）(福州邁新生物技術(shù)有限公司），DAB顯色劑（福州邁新生物技術(shù)有限公司），石蠟切片機（MICROM公司），光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS公司）。

1.2 方法

1.2.1 病理切片的制作 我們將含有腫瘤組織的蠟塊重新包埋后，由病理科技術(shù)人員以5μm的厚度連續(xù)切片，每個蠟塊切片10張，并且將每個蠟塊切成的10張切片分成兩等份，其中5張切片上用鉛筆寫上EphA2作為標(biāo)記，另外5張切片用鉛筆寫上EphrinA1作為標(biāo)記。

1.2.2 基本步驟分為：組織切片、水化、封閉內(nèi)源性過氧化物酶—修復(fù)抗原并暴露抗原決定簇—封閉特異性蛋白—加入一抗、二抗進行孵育、SP反應(yīng)—顯色劑—蘇木精復(fù)染、脫水、封片—光學(xué)顯微鏡下觀察。設(shè)置兩組對照組：以PBS緩沖液代替一抗及二抗，設(shè)置對照組。

1.3 結(jié)果判定 每例切片隨機選擇5個高倍鏡視野，計數(shù)500個以上細胞，根據(jù)著色細胞占腫瘤細胞數(shù)的比例來分為(-)和(+)。EphA2蛋白：細胞膜和細胞漿同時染成棕黃色或棕褐色的細胞，每5個高倍視野＞20%者為陽性，否則為陰性病例。EphrinA1蛋白：細胞膜和細胞漿同時染成棕黃色或棕褐色的細胞，每5個高倍視野＞10%者為陽性著色，否則為陰性。結(jié)果判斷均由兩名高年資病理科醫(yī)生統(tǒng)一核準(zhǔn)。

1.4 統(tǒng)計分析 應(yīng)用SPSS統(tǒng)計軟件分析，樣本率的比較采用χ2檢驗（當(dāng)有1個格子的理論數(shù)小于5時，采用Continuity Correction法，當(dāng)有1個格子的理論數(shù)小于1或者1/5以上格子的理論數(shù)小于5時，采用Fisher’s Exact test法，其余均采用Pearson（Chi-Square）法）；相關(guān)聯(lián)性分析采用χ2檢驗，檢驗標(biāo)準(zhǔn)均取P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EphA2蛋白在乳腺癌標(biāo)本中的表達情況 在所選取的93例乳腺癌標(biāo)本中，EphA2蛋白的陽性表達為74例，陽性表達率為79.57%。見圖1、圖2。

圖1 EphA2在乳腺癌中的陽性表達(SP×200)

圖2 EphA2在乳腺癌中的陽性表達(SP×400)

2.2 EphA2蛋白在乳腺癌的陽性表達率與乳腺癌患者的年齡、腫瘤大小、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和組織學(xué)分級的關(guān)系 據(jù)表1分析，EphA2蛋白在細胞內(nèi)的表達與患者年齡、腫瘤大小、病理類型、TNM分期無顯著差異（P＞0.05），而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤的組織學(xué)分級相關(guān)（P＜0.05），組織學(xué)分級越高，EphA2蛋白在下乳腺癌細胞內(nèi)陽性表達所占的比例越高。

在所選取的93例乳腺癌標(biāo)本中，EphrinA1蛋白的陽性表達為70例，陽性表達率為75.27%。見圖3、圖4。

圖3 EphrinA1在乳腺癌中的陽性表達(SP×200)

圖4 EphrinA1在乳腺癌中的陽性表達(SP×400)

2.3 EphrinAl蛋白在乳腺癌的陽性表達率與乳腺癌患者的年齡、腫瘤大小、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和組織學(xué)分級的關(guān)系 據(jù)表2分析，EphrinA1蛋白在細胞內(nèi)的表達和EphA2蛋白在細胞內(nèi)的表達非常相似，與患者年齡、腫瘤大小、病理類型、TNM分期無顯著差異（P＞0.05），而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤的組織學(xué)分級相關(guān)（P＜0.05），并且組織學(xué)分級越高，EphrinA1蛋白在下乳腺癌細胞內(nèi)陽性表達所占的比例越高。通過表1與表2的綜合分析，說明EphA2蛋白與EphrinA1蛋白在細胞內(nèi)的表達有非常緊密的聯(lián)系。據(jù)表3分析，EphA2蛋白與EphrinA1蛋白之間無顯著差異（P＞0.05），說明EphA2和EphrinA1之間存在相關(guān)性。有文獻報道，EphA2在細胞內(nèi)的表達可以作用于EphrinA1，促進其在細胞內(nèi)的表達。

表2 EphrinA1蛋白在乳腺癌中的表達與臨床病理因素的關(guān)系

表3 乳腺癌中EphA2的表達與EphrinA1表達的關(guān)系

3 討論

即使乳腺癌患者有著相同的臨床分期、相同的病理類型、相同的組織學(xué)分級，經(jīng)過相同方案的手術(shù)治療以及相同的放化療方案，但其預(yù)后仍然存在較大的差異，說明個體的差異性對乳腺癌的預(yù)后影響很大。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的高速發(fā)展，醫(yī)學(xué)研究已經(jīng)進入分子水平時代，傳統(tǒng)的病理組織學(xué)分類已經(jīng)不能滿足現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的研究及發(fā)展。尋找出能夠幫助乳腺癌診治及預(yù)后的分子生物學(xué)已經(jīng)成為目前研究的熱點之一。

EphrinA1是第一個被發(fā)現(xiàn)的Eph受體亞家族的配體。很多研究表明，Eph家族與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系，而Eph家族也越來越受到關(guān)注。

許多國外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，EphA2和EphrinA1在乳腺癌中的高表達與乳腺癌的進展有關(guān)，EphA2與EphrinA1的表達隨乳腺癌惡性程度的增高而逐漸增加，并且與乳腺癌患者的生存狀態(tài)有關(guān)。

EphA2受體與EphrinA1配體之間的多種交叉結(jié)合，以及與其他因子的相互作用，還有在不同細胞里的表達情況，使得其在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中起到的作用非常復(fù)雜，關(guān)于它在乳腺癌中的作用機制尚不明確，它也受到了國內(nèi)外越來越多的學(xué)者的重視，對其的研究也越來越多，相信不久的將來，其能夠成為腫瘤分子水平治療的新靶點。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，EphA2蛋白和EphrinA1蛋白共同表達于乳腺癌組織中，且與其乳腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級相關(guān)，而乳腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和組織學(xué)分級又對其治療和預(yù)后有著很重要的影響。所以EphA2蛋白和EphrinA1蛋白有望作為乳腺癌惡性程度及預(yù)后的一個指標(biāo)，也能對乳腺癌的早期診治及預(yù)后提供幫助。

綜上所述，EphA2蛋白及EphrinA1蛋白的檢測可以作為一個指標(biāo)來指導(dǎo)乳腺癌的臨床治療以及用來評估患者的預(yù)后。但是乳腺癌是一個由多因素引起的疾病，我們需結(jié)合其他因素及指標(biāo)來綜合判斷與分析，才能為乳腺癌的治療開辟一條新的大道。