Egr-1在單眼形覺剝奪性弱視幼貓視皮質中的表達及其意義

范浩博，唐秀平，楊麗源，宋唯琦，王英，陳思宇，鄒云春

(川北醫(yī)學院眼視光學系，四川 南充 637000)

弱視是造成當今世界上兒童視力下降的重要疾病之一[1]，亞洲地區(qū)的發(fā)病率約1.09%[2]。近年來，隨著分子生物學、神經生物學等多學科在弱視致病機制方面的研究深入，目前研究[3-4]證實，弱視治療的基本依據(jù)在于視覺發(fā)育敏感期內視覺可塑性的存在，而視覺發(fā)育可塑性機制與多種神經遞質相關，但具體發(fā)病機制尚未完全闡明，還不能在分子水平上詳細解釋弱視關鍵期及可塑性發(fā)生的變化。突觸目前被認為是弱視的最關鍵環(huán)節(jié)，其可塑性按時間上可分為長時程增強(long-termpotentiation，LTP)和長時程抑制(long-termdepression，LTD)。而早期生長反應因子-1(early growth responsive gene-1，Egr-1)作為即刻早期基因(Immediate-early genes，IEGs)中Egr家族內的一員，具有編碼鋅指結構的轉錄因子的作用。在突觸可塑性和記憶的鞏固以及LTP的誘導和學習過程中都伴隨著Egr-1表達的增加[5]；同時，Egr-1也具有將短時程信號與長時程改變進行偶聯(lián)的效應，但目前尚未有研究表明Egr-1的表達與弱視的關聯(lián)。本研究通過觀察形覺剝奪性弱視幼貓視皮質Egr-1的表達，探討Egr-1對視覺發(fā)育的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選取3周齡幼貓30只，性別、毛色不限，體重240～350 g，眼底鏡檢查排除屈光介質混濁及眼底異常；檢影驗光顯示幼貓屈光度為+1.25～+3.25 D。由于幼貓在年齡較小階段尚無法自主攝取固態(tài)食物，故采取人工定時喂養(yǎng)貓奶粉與飲水的方式進行飼養(yǎng)，每日喂食4～5次，保證其健康成長。待其能夠自主攝食后，每日早中晚共計3次，檢查貓糧與飲水的供應，以保證食物的充沛。飼養(yǎng)房間內溫度設定為(24±1)℃，相對濕度保持在50%，房間內各處均能夠接受自然光線照射。本研究動物均由川北醫(yī)學院實驗動物中心提供，通過川北醫(yī)學院實驗動物倫理委員會批準并全程接受監(jiān)督。

1.1.2 實驗試劑與儀器 主要試劑：PBS(PH 7.2～7.6)緩沖液(武漢Boster公司，貨號：AR0030)、枸櫞酸鹽(PH 6.0)緩沖液(武漢Boster公司，貨號：AR0024)、Egr-1抗體(Bioss公司，貨號BS-1076R)、SABC免疫組化染色試劑盒(武漢Boster公司，貨號：SA1022)、DAB顯色試劑盒(武漢Boster公司，貨號：AR1022)、Mayer`蘇木素染液(Solarbio公司，貨號：G1080)、伊紅染色液(Solarbio公司，貨號：G1100)。主要儀器：動物電極針(法國羅蘭，型號：RL-1223000030-RC-D)、視覺電生理儀(法國羅蘭，型號：RETI port/scan 21)、帶狀檢影鏡(蘇州六六，型號：YZ24B)、病理切片機(Leica，型號：RM2235)、顯微成像系統(tǒng)(尼康，型號：DS-Fi2)

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立 隨機數(shù)字表法將幼貓分為形覺剝奪組與對照組，每組15只。采用1%戊巴比妥鈉(35 mg/kg)腹腔注射麻醉兩組幼貓。對照組僅做麻醉處理；剝奪組在麻醉后采用“套環(huán)遮蓋法”[6]進行弱視造模：將3-0線在其右眼眼眶四周對稱做四個小套環(huán)，用縫線穿過套環(huán)連接黑色不透明遮蓋布，并于中央制作了一個高約0.7 cm，直徑為3 cm的環(huán)形遮蓋圈，防止光線從側面透過(圖1A)。剝奪組遮蓋前與遮蓋后的第1、3、5周，對剝奪組幼貓右眼、左眼與對照組右眼行圖形視覺誘發(fā)電位(pattern visual evoked potential，PVEP)檢測。PVEP檢測需矯正幼貓屈光不正，檢測前將幼貓遮蓋布套環(huán)上的連接線剪斷，取下遮蓋布，采用帶狀檢影鏡進行檢影驗光以確定幼貓雙眼屈光度(圖1B)。PVEP檢測時，將三根動物電極針分別依次插入：參考電極(藍色)置于前額正中皮下，作用電極(紅色)置于雙耳連線枕部皮膚正中皮下，接地電極(黑色)置于耳尖皮下。調整幼貓頭位使其被檢測眼視軸與屏幕中央處于同一水平線上(圖1C)。PVEP采用棋盤翻轉模式進行刺激，距離為50 cm，刺激模式設定為0.3 cpd，視角16.7°，時間頻率為1 Hz，對比度97%，采樣時間300 ms，疊加64次。并根據(jù)此前檢影驗光結果，選取相應鏡片對其屈光不正進行足矯，于暗室條件下進行檢測，每只眼重復三次取平均值。檢測過程中隨時觀察并調整幼貓頭位使其檢測眼視軸與屏幕中央處于同一水平線上。檢測后記錄剝奪組幼貓右眼、左眼與對照組幼貓右眼的P100波振幅與潛伏期。動物弱視模型建立的成功標準以剝奪組右眼與剝奪組左眼、剝奪組右眼與對照組右眼之間P100波振幅與潛伏期存在統(tǒng)計學時即認為弱視造模成功[7-8]。

1.2.2 取材與切片制作 遮蓋后第5周PVEP檢查完成后，根據(jù)《貓解剖彩色圖譜》將所有幼貓進行視皮質與外側膝狀體取材：使用解剖刀從枕外隆突處向前額骨處劃開皮膚，剝離顱骨外軟組織，使顱骨面暴露(圖2A)。使用直剪從枕骨處剪開顱骨，并向前端繼續(xù)分離兩側顱骨，直至腦組織完全暴露。用組織剪剪斷腦部組織與脊髓處的連接，用鑷子輕輕提起整個腦組織，從腦組織下方可看見視交叉，剪斷視交叉后，即可使整個腦部組織脫離。由背視視角即可見端腦枕回(圖2B)；由腹視視角可見端腦梨狀葉，分離梨狀葉，暴露外側膝狀體(圖2C)。隨后快速切下端腦枕回與間腦外側膝狀體部，并立即將其放入4 %多聚甲醛固定液(含DEPC)中固定，隨后脫水包埋。采用石蠟切片機進行切片，切片厚度設定為4 μm。

1.2.3 HE染色及免疫組化 HE染色：石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，滴加蘇木素染液，1%鹽酸酒精分化后，滴加伊紅染液，脫水封片。顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。免疫組化：石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，3 % H2O2消除內源性過氧化物酶活性，微波熱修復抗原，5 % BSA封閉液封閉，滴加一抗，滴加生物素標記山羊抗兔IgG，滴加SABC，DAB顯色，蘇木素復染細胞核，脫水封片，顯微成像系統(tǒng)下進行圖像采集分析陽性細胞數(shù)與陽性細胞平均光密度。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 PVEP檢測

PVEP檢測顯示，幼貓PVEP主波圖像表現(xiàn)為N75-P100-N135復合波，該波具有兩個正向波與一個負向波共同構成，呈“M”狀(圖2.1)。遮蓋前，剝奪組右眼、左眼與對照組右眼在P100波潛伏期差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；遮蓋3周后，三組P100波潛伏期與振幅差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；剝奪組右眼P100波潛伏期高于剝奪組左眼與對照組右眼(P<0.05)；剝奪組右眼振幅低于剝奪組左眼與對照組右眼(P<0.05)；遮蓋5周后，剝奪組右眼P100波潛伏期高于剝奪組左眼與對照組右眼(P<0.05)；剝奪組右眼振幅低于剝奪組左眼與對照組右眼(P<0.05)。提示遮蓋3周后，剝奪組幼貓右眼已形成單眼形覺剝奪性弱視。見圖3、圖4、表1及表2。

表1 各組遮蓋前后P100波振幅變化

表2 各組遮蓋前后P100波潛伏期變化

2.2 HE染色

HE染色顯示，遮蓋5周后，對照組幼貓視皮層神經元細胞形態(tài)以多角形、不規(guī)則型居多，細胞間結構緊密；形覺剝奪組視皮層神經元細胞形態(tài)多為圓形，少數(shù)呈不規(guī)則狀；局部膠質細胞增生，海綿狀變性，部分神經元水腫、變性。見圖5。

2.3 免疫組織化學檢測

免疫組化檢測結果表明，遮蓋5周后兩組幼貓大腦視皮質中均有Egr-1的陽性信號，即存在Egr-1表達，表達位于細胞胞漿之中，呈棕黃色，細胞核呈藍色。剝奪組中大部分呈現(xiàn)陽性或弱陽性，陽性細胞數(shù)較少；對照組表達強陽性信號較強；剝奪組陽性細胞數(shù)與平均光密度均低于對照組(P<0.05)。見表3及圖6。

表3 免疫組織化學檢測

3 討論

形覺剝奪性弱視是由于嬰幼兒時期，因先天性白內障、上瞼下垂、角膜白斑等原因，使光線不能或不正常進入眼內，剝奪了黃斑接受正常光線刺激的機會。其生理性刺激的減少，使處于發(fā)育期內的黃斑產生發(fā)育不良或停滯[1]。對于幼貓而言，形覺剝奪對其視力的影響一般在出生后至4周齡時達到頂峰，在12周齡后，遮蓋產生的形覺剝奪幾乎不能夠對其視力發(fā)育進行干擾[9]。因此，選用3周齡的幼貓通過單眼形覺剝奪的方式建立弱視模型。目前，形覺剝奪性弱視造模的經典方法為上瞼縫合法，本小組既往曾采用“套環(huán)遮蓋法”[10]，即利用黑色遮蓋布替代眼瞼縫合進行弱視造模。在避免眼瞼縫合對眼前節(jié)產生損傷的同時，利用剪斷連接線實現(xiàn)了對實驗動物PVEP變化的連續(xù)觀察。該方法可以有效阻擋動物遮蓋眼各方向的光線進入眼內，并順利建立弱視動物模型。但造模期間內仍出現(xiàn)個別幼貓頭部運動導致遮蓋布側方有光線透過。為改進這一情況，本實驗在原遮蓋方法上加大了遮蓋布的直徑，并在遮蓋布中央制成具有一定高度的黑色不透明遮蓋環(huán)，以進一步提升遮蓋效能。

本實驗PVEP檢測采用棋盤翻轉刺激，記錄到幼貓PVEP主波圖像由兩個正向波與一個負向波構成，呈“M型”。通過比對同時間不同眼與同眼不同時間P100波振幅與潛伏期，提示改良后的遮蓋方法是可行有效的。通過“套環(huán)遮蓋法”能夠成功建立單眼形覺剝奪性弱視動物模型，并能實現(xiàn)對實驗動物的眼部生理參數(shù)動態(tài)檢測。

隨著近年來弱視研究深入開展，多種參與視覺發(fā)育可塑性機制的神經遞質，如AMPA受體及其GluR2亞基、NEP1-40、突觸素、膽堿能神經元、生長相關蛋白-43、GABA、cPKC-r、NMDAR、NGR-1等[11]都被認為與弱視相關，但仍然不能完全從分子水平上解釋弱視關鍵期與其可塑性變化的關系[3-4]。即刻早期基因作為一類可編碼轉錄因子的原癌基因[12],具有偶聯(lián)短時程信號與長時程改變的效應，主要包括C-fos、Egr家族以及Arc等,其中有不少轉錄因子都受到視覺活動的調節(jié)。其中，已有充分證據(jù)顯示C-fos與弱視疾病的關聯(lián)性。即刻早期基因中Egr家族內的Egr-1[13]，其轉錄因子在視皮層可塑性變化中是必需的。Egr-1是一種編碼鋅指結構的轉錄因子，在突觸可塑性和記憶鞏固及LTP的誘導和學習過程中，都伴隨著Egr-1表達增加[5]。而細胞骨架相關基因Arc作為Egr-1的靶基因之一，是一個突觸活性誘導的效應分子，在晚期LTP中具有重要作用。有研究[13]表明，一定條件下，Egr-1可以調控海馬CA1區(qū)晚期活性依賴性Arc基因轉錄，即刻早期基因Arc因其具有多能、精細調諧系統(tǒng)，能夠連接神經活動的變化模式和突觸可塑性，從而優(yōu)化神經系統(tǒng)信息存儲。本實驗利用HE染色與免疫組化分別對遮蓋5周后的弱視幼貓視皮質與對照組視皮質的組織形態(tài)學差異和Egr-1蛋白表達進行了對比與分析。提示在弱視幼貓模型中，視皮層神經元細胞組織形態(tài)發(fā)生變化，并且伴隨局部膠質細胞增生。既往弱視動物模型的研究[14-15]發(fā)現(xiàn)弱視動物的神經節(jié)細胞、外側膝狀體、視皮質都存在結構方面的變化，并伴隨著突觸密度下降，這些結構上的變化，又會導致其功能方面進一步改變。本實驗研究結果提示在視覺發(fā)育關鍵期內，由于雙眼視覺不對等輸入，可能會導致視皮質細胞數(shù)目及形態(tài)發(fā)生變化，從而Egr-1蛋白表達下降，而Egr-1蛋白表達下降又進一步對視皮質的正常生理功能產生異常影響，影響視覺發(fā)育，從而促進了弱視的發(fā)生發(fā)展。

視皮層軸突水平的興奮與抑制的平衡是維持視皮層正常發(fā)育和功能的條件，也是影響視覺系統(tǒng)可塑性的重要因素[16]。視神經沖動在腦的第一個突觸接替發(fā)生在外側膝狀體(LGN)，每側的LGN接收來自同側視網膜顳側半視纖維和來自對側視網膜鼻側半視纖維的投射，這種投射具有嚴格的局部區(qū)域對應關系。神經的可塑性主要表現(xiàn)于突觸結構和功能的可塑性。弱視發(fā)生與突觸可塑性改變有關，弱視產生過程中會產生長時程改變，Egr-1和Arc基因與突觸長時程改變密切相關。目前多數(shù)研究也表明知覺學習可以提高弱視患者的視覺功能[17]，知覺學習是通過反復的視覺刺激，以及具有監(jiān)督和反饋作用的視覺體驗，使視功能得到有效的恢復[18]。研究者發(fā)現(xiàn)其機制可能與可塑性相關的興奮和抑制平衡有關聯(lián)，而Egr-1和Arc又在人與動物的學習記憶中發(fā)揮重要作用[19]。本實驗研究進一步證實了在弱視發(fā)病過程中，視皮質的Egr-1蛋白表達會產生下降，進一步驗證了知覺學習在弱視治療中的作用。

綜上所述，采用套環(huán)遮蓋法可以實現(xiàn)弱視動物模型的建立和眼球參數(shù)的動態(tài)測量。基于這一方法所制作的弱視動物模型，發(fā)現(xiàn)Egr-1在視皮質的表達明顯下降。本實驗推測Egr-1在視覺發(fā)育過程中起到了重要作用。本研究為進一步探索單眼形覺剝奪是如何調控視皮層神經元，為治療弱視與深入了解其發(fā)病機制提供了新的思路與方向。