干擾UCP2保護(hù)H9C2心肌細(xì)胞免受缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡并抑制細(xì)胞自噬

張 莉 李 峰 劉悅雁 王艷梅 章辰琛

皖西衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院1.解剖教研室；2.生理教研室，安徽六安 237005

細(xì)胞凋亡導(dǎo)致的心肌細(xì)胞缺失已被證明與許多心血管疾病有關(guān)，如心力衰竭、進(jìn)行性左心室功能障礙和擴(kuò)張型心肌?。?］。心臟是一個(gè)持續(xù)需要ATP供給的高能量需求器官，來自線粒體的解偶聯(lián)蛋白家族能夠通過降低質(zhì)子梯度來解偶聯(lián)ATP合成。解偶聯(lián)蛋白 2（uncoupling protein 2，UCP2）于 1997 年被發(fā)現(xiàn)，并在多種組織中發(fā)揮著重要作用，例如調(diào)節(jié)活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成、調(diào)節(jié)胰島素代謝、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡等［2-4］。然而現(xiàn)有的文獻(xiàn)中有許多相互矛盾的研究結(jié)果，一些研究顯示UCP2具有心肌保護(hù)作用，而其他研究則顯示出相反的作用。尤其是在心肌缺氧過程中，UCP2對(duì)心肌細(xì)胞的作用并不明晰。

心臟缺血再灌注可引起心臟組織不可逆損害，這其中主要的原因是心肌細(xì)胞缺氧（hypoxia）［5］?，F(xiàn)有的研究顯示，心肌細(xì)胞缺氧可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS水平增高、Ca2+超載以及無(wú)機(jī)磷酸鹽水平升高［6］。這些因素可導(dǎo)致線粒體內(nèi)膜非選擇性離子通道開放，引起線粒體內(nèi)膜膜電位消失，呼吸鏈解偶聯(lián)，細(xì)胞色素C 以及促凋亡因子外流，從而引起細(xì)胞凋亡［7-8］。自噬是廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)的一種細(xì)胞分解自身構(gòu)成成分的生理現(xiàn)象?，F(xiàn)在的研究表明，缺血缺氧是細(xì)胞自噬激活的重要誘因之一［9］。自噬強(qiáng)度增加可促進(jìn)細(xì)胞在缺血缺氧等狀態(tài)下的存活，然而如果自噬水平過度上調(diào)，將引起自噬性細(xì)胞死亡，即Ⅱ型細(xì)胞程序性死亡［10］。在缺氧引起的細(xì)胞凋亡和自噬過程中，UCP2的作用仍不清楚。

本研究首先分析了大鼠心肌細(xì)胞H9C2在缺氧環(huán)境下UCP2的表達(dá)水平，隨后檢測(cè)了干擾UCP2對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS 生成的影響。通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)干擾UCP2對(duì)H9C2缺氧后細(xì)胞凋亡的影響，通過蛋白免疫印跡檢測(cè)干擾UCP2 對(duì)H9C2 缺氧后細(xì)胞損傷以及細(xì)胞自噬的影響。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

大鼠胚源性心肌細(xì)胞H9C2購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)保存委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)（中國(guó)上海）。H9C2細(xì)胞膜擁有人心肌細(xì)胞的大多數(shù)特征，主要用來研究UCP2 在體外細(xì)胞培養(yǎng)中的作用。細(xì)胞培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)基（Gibco BRL，北京，中國(guó)）中，含有10%胎牛血清，培養(yǎng)條件為95%N2，5%CO2，37 ℃。細(xì)胞培養(yǎng)過程中定期傳代。

1.2 細(xì)胞內(nèi)ROS測(cè)定

使用非熒光探針DCFH-DA（Beyotime）對(duì)H9C2細(xì)胞中的ROS進(jìn)行熒光檢測(cè)。用胰蛋白酶將6孔細(xì)胞板中的細(xì)胞進(jìn)行消化，離心收集。用DMEM稀釋DCFH-DA 至 10 μm 后添加到 H9C2 細(xì)胞中，然后在37 ℃孵育20 min，隨后用PBS 洗滌3 次。使用多功能微孔儀（Spectramax M5/M5）在488 nm激發(fā)波長(zhǎng)和525 nm發(fā)射波長(zhǎng)下讀取DCF熒光。

1.3 RT-qPCR

為了檢測(cè)UCP2 的mRNA 表達(dá)水平，使用Trizol試劑（Invitrogen Life Technologies）從H9C2細(xì)胞中提取總RNA，然后使用RT-PCR 試劑盒（TAKARA，日本）逆轉(zhuǎn)錄并合成cDNA。RT-qPCR 體系為10 uL，包含0.25 uL引物、5 uL SYBP 和4 uL cDNA。UCP2引物為：Forward：5′-GGG CAC CTG TGG TGC TAC CTG-3′；Reverse：5′-ATG-AGC-TTT-GCC-TCC-CGC-3′。

1.4 shRNA轉(zhuǎn)染

通過上?；蛴邢薰竞铣蓅hRNA-UCP2和陰性對(duì)照 shRNA-NC。 shRNA-UCP2 序列如下：Forward：5′-GCA CUG UCG AAG CCU ACA A dTdT-3′，Reverse：5′-UUG UAG GCU UCG ACA GUG C dTdT-3′。 shRNA-NC 序 列 Forward：5′-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3′，Reverse：5′-ACG UGA CACGUU CGG AGA ATT-3′。根據(jù)制造商說明，使用 Lipofectamine 2000（Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA，USA）轉(zhuǎn)染。首先用無(wú)血清DMEM 培養(yǎng)基（GiBCO To，美國(guó)）分別稀釋shRNA（nmol/L）和Lipofectamine 2000，并共同孵育20 min，然后將復(fù)合物添加到H9C2 細(xì)胞中，培養(yǎng)6 h 后，更換培養(yǎng)基。

1.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

H9C2 細(xì)胞用PBS 洗滌后用70%乙醇固定，然后將固定后的細(xì)胞在PBS 中洗滌2 次，隨后用PI/FITC AnnexinV 染色（50 μg/mL RNA 酶），室溫下避光孵育1 h。通過流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡，利用FLOWJO軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.6 蛋白質(zhì)印跡

裂解細(xì)胞后用BCA 法進(jìn)行蛋白定量。取等量蛋白樣品（30 mg）上樣，隨后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜（billerica，美國(guó)）。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h，隨后一抗（1∶1000）孵育過夜。第2 天TBST 洗膜3 次，然后用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育。TBST洗滌后顯影成像。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 7 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所用數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（±SEM），組與組之間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組之間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 缺氧環(huán)境下UCP2在心肌細(xì)胞H9C2中的表達(dá)

本實(shí)驗(yàn)通過RT-qPCR 檢測(cè)缺氧環(huán)境下大鼠心肌細(xì)胞H9C2中UCP2的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，缺氧環(huán)境下UCP2 的表達(dá)量明顯升高（圖1A，P ＜0.001）。隨后將 shRNA-UCP2 轉(zhuǎn)染至 H9C2 中干擾UCP2的表達(dá)水平。轉(zhuǎn)染shRNA-UCP2后的H9C2細(xì)胞均發(fā)出紅色熒光，在熒光顯微鏡下記錄帶有紅色熒光的細(xì)胞數(shù)目以及總細(xì)胞數(shù)目，確定24 h后的轉(zhuǎn)染效率。在隨機(jī)檢測(cè)的600個(gè)H9C2細(xì)胞中，其轉(zhuǎn)染效率為83.2%（圖1B）。隨后進(jìn)一步通過蛋白免疫實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干擾后UCP2 的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染了 shRNA-UCP2 后 H9C2 細(xì)胞中 UCP2 的表達(dá)水平明顯下降（圖1C，P ＜0.01），同時(shí)免疫印跡實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了H9C2 在缺氧培養(yǎng)后UCP2 的表達(dá)在蛋白水平上也明顯升高（圖1D，P ＜0.001）。

圖1 缺氧環(huán)境下UCP2在心肌細(xì)胞H9C2中的表達(dá)

2.2 干擾UCP2對(duì)缺氧環(huán)境下心肌細(xì)胞H9C2細(xì)胞內(nèi)ROS含量的影響

本實(shí)驗(yàn)通過非熒光探針DCFH-DA 與ROS 反應(yīng)，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS 水平。DCFH-DA 擴(kuò)散至細(xì)胞中去乙?；蔀镈CFH，隨后DCFH 與ROS 在細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)轉(zhuǎn)化為可發(fā)出熒光的DCF。由于DCF 無(wú)法透過細(xì)胞膜，在熒光顯微鏡下觀察熒光強(qiáng)度即可判斷細(xì)胞內(nèi)ROS的水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，缺氧環(huán)境下H9C2 細(xì)胞內(nèi)ROS 熒光強(qiáng)度明顯升高（圖2A），而干擾UCP2 表達(dá)后，可明顯降低細(xì)胞內(nèi)ROS 熒光強(qiáng)度（圖2B，P ＜0.01）。因此，干擾UCP2可降低心肌細(xì)胞缺氧后ROS水平。

圖2 干擾UCP2對(duì)缺氧環(huán)境下心肌細(xì)胞H9C2細(xì)胞內(nèi)ROS含量的影響

2.3 干擾UCP2對(duì)缺氧環(huán)境下心肌細(xì)胞H9C2細(xì)胞凋亡的影響

通過流式細(xì)胞檢測(cè)干擾UCP2對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的作用。缺氧會(huì)引起細(xì)胞凋亡，而心肌細(xì)胞對(duì)于缺氧更為敏感。本實(shí)驗(yàn)通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)缺氧以及干擾UCP2對(duì)H9C2細(xì)胞的凋亡作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相比于正常環(huán)境下培養(yǎng)的H9C2 細(xì)胞，缺氧可顯著增加H9C2細(xì)胞凋亡率（P＜ 0.001）；干擾UCP2表達(dá)后，可顯著降低H9C2細(xì)胞凋亡率（P＜0.01），見圖3。因此，干擾UCP2表達(dá)可降低由缺氧引起的心肌細(xì)胞凋亡。

圖3 干擾UCP2對(duì)缺氧環(huán)境下心肌細(xì)胞H9C2細(xì)胞凋亡的影響

2.4 干擾UCP2對(duì)缺氧環(huán)境下心肌細(xì)胞H9C2細(xì)胞損傷及炎癥水平的影響

為了進(jìn)一步研究UCP2在缺氧導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡以及損傷的作用，本研究通過蛋白免疫印跡檢測(cè)了cleaved caspase-3 的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，缺氧環(huán)境下H9C2 細(xì)胞cleaved caspase-3 表達(dá)水平明顯升高（P＜ 0.001），而干擾UCP2 可顯著降低cleaved caspase-3的表達(dá)量（P＜ 0.01）。見圖4。

圖4 干擾UCP2對(duì)缺氧環(huán)境下心肌細(xì)胞H9C2細(xì)胞損傷及炎癥水平的影響

CK 和LDH 水平是衡量H9C2細(xì)胞（20-22）損傷程度的生化指標(biāo)，細(xì)胞上清液中CK 和LDH 水平與細(xì)胞損傷程度呈正相關(guān)，而TNF-α和IL-6是心肌細(xì)胞缺氧損傷后重要的炎癥因子。如圖4 所示，H9C2 細(xì)胞缺氧培養(yǎng)后，細(xì)胞上清液中CK、LDH、TNF-α和IL-6的水平明顯高于對(duì)照組（P＜ 0.001）；而干擾UCP2 表達(dá)水平后，同樣在缺氧環(huán)境下，H9C2 細(xì)胞上清液中 CK、LDH、TNF-α 和 IL-6 水平均顯著下降（P＜0.01）。我們的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步說明了，干擾UCP2 可顯著降低缺氧引起的細(xì)胞凋亡及損傷。

2.5 干擾UCP2對(duì)缺氧環(huán)境下心肌細(xì)胞H9C2細(xì)胞自噬的影響

為了研究干擾UCP2對(duì)缺氧引起細(xì)胞自噬的影響，采用蛋白印跡法分析了LC3-II/LC3-I、Beclin-1和p62 的蛋白水平。如圖5 所示，缺氧顯著增加了LC3-II/LC3-I和Beclin-1的表達(dá)水平，但顯著降低了p62 的表達(dá)水平（P＜ 0.01），表明缺氧誘導(dǎo)了H9C2細(xì)胞自噬；干擾UCP2 的表達(dá)后，同樣在缺氧環(huán)境下，H9C2 細(xì)胞中 LC3-II/LC3-I 和 Beclin-1 的表達(dá)水平顯著降低，而p62顯著升高（P＜0.05）。因此，干擾UCP2表達(dá)可抑制缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬。

圖5 干擾UCP2對(duì)缺氧環(huán)境下心肌細(xì)胞H9C2細(xì)胞自噬的影響

3 討 論

再灌注療法是目前臨床急性心肌梗死的主要治療手段，是一個(gè)缺氧后復(fù)氧的過程［11］。然而這種治療方法可導(dǎo)致心肌細(xì)胞缺氧，引起一系列不可逆轉(zhuǎn)的傷害。心臟是一個(gè)高能量需求器官，心肌細(xì)胞缺氧可引起電子傳遞鏈解偶聯(lián)，最終引起細(xì)胞凋亡［12］。

在電子傳遞鏈中，解偶聯(lián)蛋白是ATP和ROS產(chǎn)生的關(guān)鍵因子，通過跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)H+降低線粒體質(zhì)子濃度梯度從而生成ATP。當(dāng)細(xì)胞遭受外界應(yīng)激時(shí)，如缺氧，電子傳遞鏈解偶聯(lián)，釋放大量ROS［13］。在解偶聯(lián)蛋白5種同系物中，UCP2在全身組織中普遍表達(dá)；例如肝臟、大腦、胰腺、脂肪組織、免疫細(xì)胞、脾臟、腎臟和心臟［14］?，F(xiàn)有的研究表明，UCP2敲除小鼠的線粒體 ROS 含量增加［15］。此外，UCP2 還參與調(diào)節(jié)其他生理或病理事件，如動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成、食物攝入和代謝疾病［16］。鑒于UCP2 在調(diào)節(jié)線粒體ROS產(chǎn)生和細(xì)胞能量傳遞中的核心作用，本研究主要集中在UCP2對(duì)缺氧引起的心肌細(xì)胞凋亡以及自噬的影響。

本研究首先通過RT-qPCR 檢測(cè)了缺氧環(huán)境下心肌細(xì)胞H9C2中UCP2的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)缺氧可顯著引起UCP2表達(dá)升高。UCP2位于電子傳遞鏈中，在病理情況下，線粒體又是ROS的主要生產(chǎn)場(chǎng)所。隨后我們應(yīng)用ROS熒光反應(yīng)檢測(cè)了UCP2在缺氧環(huán)境下對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS 生成的影響。我們通過RNA 干擾的手段，降低H9C2 內(nèi)UCP2 的表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，干擾UCP2 表達(dá)后可顯著降低缺氧引起的ROS水平升高。

目前，UCP2的確切生理作用尚不清楚，有研究證明UCP2 過度表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［17］。然而UCP2在缺氧導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡過程中的作用并不清楚。在我們的研究中，流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，干擾UCP2 表達(dá)后可顯著降低缺氧導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞缺氧可導(dǎo)致線粒體內(nèi)膜非選擇性孔道開放，細(xì)胞色素c以及凋亡誘導(dǎo)因子外流。細(xì)胞色素c外流后生成凋亡小體復(fù)合物活化caspase9，最后激活caspase3 引起細(xì)胞凋亡。本研究檢測(cè)了cleavedcaspase3以及細(xì)胞損傷相關(guān)因子，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，干擾UCP2 表達(dá)可顯著降低缺氧引起的cleavedcaspase3、LDH、CK、IL-6 和TNF-α 升高。然而有些實(shí)驗(yàn)表明，UCP2本身可引起細(xì)胞存活率下降，這與我們的抗凋亡結(jié)果相矛盾，這背后的抗凋亡機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

自噬在各種生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用，例如加速細(xì)胞內(nèi)的新陳代謝，或者在細(xì)胞處于缺血缺氧等狀態(tài)時(shí)從分解產(chǎn)物中獲得能量。大量研究表明增強(qiáng)的自噬促進(jìn)了細(xì)胞在缺血缺氧等饑餓狀態(tài)下的存活，然而過度的細(xì)胞自噬可引起細(xì)胞程序性死亡［18］。本實(shí)驗(yàn)研究了UCP2 在缺氧條件下對(duì)心肌細(xì)胞自噬的影響，通過蛋白免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞自噬相關(guān)因子LC3-II/LC3-I、Beclin-1和p62，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示干擾UCP2 能顯著逆轉(zhuǎn)缺氧引起的細(xì)胞自噬。

綜上，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，缺氧可引起UCP2表達(dá)升高，干擾UCP2 可顯著降低缺氧引起的細(xì)胞凋亡及自噬。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突