青海和甘肅地區(qū)牦牛病毒性腹瀉病的感染檢測(cè)

石洪中，張斌，湯承，岳華*

（1.閬中市科安康獸藥服務(wù)部，四川 閬中 637400；2.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041）

牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）是牛病毒性腹瀉（BVD）的病原體［1］，在全球許多國家流行，給全球養(yǎng)牛業(yè)造成了相當(dāng)大的經(jīng)濟(jì)損失［2-3］。BVDV病毒顆粒呈球形，是一種有囊膜的單股正鏈RNA 病毒，屬黃病毒科，犬瘟熱病毒屬，基因組長(zhǎng)度約12.5 kb?；蚪M編碼產(chǎn)生至少11 個(gè)成熟的蛋白質(zhì)，5′UTR區(qū)域調(diào)節(jié)病毒復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯［4］。研究表明，根據(jù)其5′非翻譯區(qū)核苷酸序列，將BVDV分為BVDV-1和BVDV-2兩種不同基因型［5］。

近年來，我國牦牛感染BVDV 的情況日趨嚴(yán)重，給牦牛產(chǎn)業(yè)造成了嚴(yán)重?fù)p害［6-9］。盡管現(xiàn)有疫苗產(chǎn)生的保護(hù)效率并不理想，但疫苗接種仍然是預(yù)防BVDV 感染的主要防控措施［10］。本研究采用ELISA和RT-PCR方法分別檢測(cè)牦牛血清和糞便中的BVDV 抗體和抗原，旨在豐富我國牦牛BVDV流行病學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本采集 2020 年從牦牛屠宰場(chǎng)采集來自青海和甘肅的72 只健康牦牛的糞便和血清樣本，包括72 份糞便和72 份血清共計(jì)144 份樣本，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑與儀器 Trizol 試劑（RNAiso Plus）、PrimeScriptTMRT 試劑盒和Marker Ⅱ購自寶生物工程（大連）有限公司，Quick Taq HS DyeMix購自東洋紡（上海）生物科技有限公司，牛病毒性腹瀉病毒抗體檢測(cè)試劑盒購自IDEXX 公司（生產(chǎn)批號(hào)為J621），普通PCR 儀、核酸蛋白電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)Versa Doc2000 均購自Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 血清樣本中BVDV抗體的檢測(cè) 用BVDV抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)牦牛血清樣本中是否存在BVDV抗體，具體方法參照說明書。

1.2.2 牦牛糞便樣本總RNA 的提取 將黃豆粒大小的糞便樣本加入裝有400 μL DMEM 的EP管中，根據(jù)生產(chǎn)商說明，使用RNAios Plus提取病毒RNA。反轉(zhuǎn)錄按照PrimeScriptTMRT 試劑盒說明書進(jìn)行，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于-20 ℃保存。

1.2.3 糞便樣本中BVDV的檢測(cè)及序列測(cè)定 以72 份牦牛樣本的cDNA 為模板，使用Quick Taq HS DyeMix 進(jìn)行BVDV 檢測(cè)，具體方法參照說明書。將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物有限公司雙向測(cè)序。在NCBI 中對(duì)拼接的基因組序列進(jìn)行比對(duì)。

1.2.4 BVDV序列分析 利用MegAlign軟件進(jìn)行同源性分析；采用Mega 7.0 軟件用鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap值選擇1000重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 BVDV 抗體檢測(cè)結(jié)果 采用ELISA 方法對(duì)72份牦牛血清進(jìn)行BVDV抗體檢測(cè)，結(jié)果得出：5個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)的BVDV 抗體總陽性率為70.8%，場(chǎng)陽性率為100%；各場(chǎng)陽性率在64.3%～100%之間，其中甘肅場(chǎng)2的陽性率為100%，其他4個(gè)場(chǎng)的陽性率差異較小，在64.3%～70%之間。詳見表1。

2.2 BVDV 抗原檢測(cè)結(jié)果 對(duì)72 份健康牦牛糞便樣本進(jìn)行BVDV檢測(cè)，結(jié)果顯示：共檢出BVDV陽性樣本11 份，5 個(gè)場(chǎng)中有3 個(gè)場(chǎng)檢出BVDV 陽性，檢出率為60%（95%CI＝14.7%～94.7%）；甘肅場(chǎng)2 和青海場(chǎng)1 的抗原陽性率較高，均為42.9%，青海場(chǎng)2 的陽性率相對(duì)較低，其他場(chǎng)未檢出。值得注意的是，青海場(chǎng)1 有兩份樣本的BVDV 抗體檢測(cè)為陰性，但BVDV 抗原檢測(cè)為陽性（表1）。

表1 牦牛血液樣本BVDV抗體和抗原檢測(cè)結(jié)果

2.3 BVDV 5′UTR序列分析 將靶基因?yàn)?′UTR的BVDV檢測(cè)引物陽性產(chǎn)物經(jīng)克隆轉(zhuǎn)化后送生工生物有限公司測(cè)序，獲得1株BVDV 5′UTR序列，命名為QHF4毒株。通過Mega 7.0軟件進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，結(jié)果顯示：本研究獲得的BVDV毒株與2019 年中國分離的毒株和2012 年巴西分離的毒株（GenBank No.MN417904 和MN022918）親緣關(guān)系最近，同屬于1a 型BVDV。同源性分析結(jié)果與遺傳進(jìn)化分析的結(jié)果一致，本研究獲得的BVDV毒株與中國分離株和巴西分離株的同源性均為100%，與參考序列中其他毒株的同源性為96.8%～99.6%。

3 討論

據(jù)以往的研究報(bào)道，我國各地區(qū)牦牛BVDV抗體陽性率的差異較大，為7.91%～84.24%不等［11-12］。本研究采用ELISA 方法對(duì)72 份健康牦牛的血清樣本進(jìn)行了BVDV 抗體檢測(cè)，共檢出陽性血清51 份，血清抗體陽性率平均為70.8%，遠(yuǎn)高于已報(bào)道的青海和甘肅的牦牛BVDV抗體陽性率（18.09%～24.66%）［13］，表明該地區(qū)BVDV 的感染率可能正在明顯上升。

國內(nèi)病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示BVDV 在我國牛場(chǎng)中普遍存在，在牦牛中也常有報(bào)道，牦牛腹瀉糞便中BVDV 的檢出率為22.19%～40.0%［14］。本研究72份牦牛糞便的BVDV檢出率為15.3%。由于本研究采集的樣本為健康牦牛糞便樣本，因此該地區(qū)實(shí)際的BVDV 流行率應(yīng)該更高。BVDV進(jìn)入機(jī)體后可造成免疫抑制和持續(xù)性感染［15］。持續(xù)感染時(shí)，患病?？山K身帶毒，但牦牛血清中BVDV 的抗體檢測(cè)卻為陰性，在免疫功能低下或應(yīng)激時(shí)感染牦?？上蛲馀哦?，并且降低感染牦牛的免疫力，引起其他病原的混合感染或繼發(fā)感染［15-16］。本研究中有兩份來自青海的樣本為抗體檢測(cè)陰性但抗原檢測(cè)陽性，提示這兩只牦牛存在持續(xù)性感染。疫苗免疫接種是防控BVDV的關(guān)鍵，我國現(xiàn)有的BVDV 疫苗主要以滅活苗為主，而滅活疫苗接種后無法通過抗體檢測(cè)來區(qū)分是疫苗免疫還是自然感染所產(chǎn)生的抗體，這不利于BVDV的防控和凈化。

BVDV 分為BVDV-1 型和BVDV-2 型兩種基因型，這兩種基因型在世界范圍內(nèi)廣泛存在。BVDV-1 型和BVDV-2 型又分為不同的亞型，其中BVDV-1a、BVDV-1b、BVDV-2a 和BVDV-2b流行較為廣泛［17］，青藏高原地區(qū)的牦牛主要以BVDV-1d亞型感染為主［8］。本研究獲得的BVDV毒株經(jīng)遺傳進(jìn)化分析顯示屬于BVDV-1a亞型，這表明與BVDV-1d 一樣，BVDV-1a 在青藏高原的牦牛中已經(jīng)普遍存在。盡管BVDV-1a 亞型在青藏高原牦牛中已有相關(guān)報(bào)道［8］，但其具體的流行情況仍然需要更加廣泛系統(tǒng)的流行病學(xué)調(diào)查。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果揭示了我國西北部分地區(qū)牦牛感染BVDV的現(xiàn)狀，其感染率正在明顯升高，提示應(yīng)加強(qiáng)對(duì)牦牛群BVDV的監(jiān)測(cè)?！?/p>