病理組織芽生菌感染的特殊染色方法分析

謝文林，唐翠蘭，連家燕*

（1中山大學附屬第七醫(yī)院病理科，深圳 518107；2中山大學附屬第一醫(yī)院病理科，廣州 510080）

著色芽生菌病（chromoblastomycosis，CBM）是由多種暗色真菌引起的皮膚和皮下組織的慢性肉芽腫性疾病[1]。CBM的確診須借助組織病理和真菌學檢查。病理組織可見厚壁棕黃色孢子，同時伴有表皮假上皮瘤樣增生、化膿性肉芽腫性炎、纖維增生機化等病理改變，具有診斷意義。真菌學檢查主要包括膿液或皮損組織直接鏡檢，可見棕色圓形厚壁分隔的孢子（硬殼小體）[2]。本研究對15例已明確診斷為芽生菌感染的石蠟包埋組織同時進行PAS染色、六胺銀染色、抗酸染色和愛爾新藍染色（pH2.5），比較這4種染色方法檢測顯示病變組織中芽生菌的優(yōu)缺點，探討哪一種特殊染色方法更適合于臨床病理診斷。

材料與方法

1 材料

選取中山大學附屬第一醫(yī)院2008~2021年及中山大學附屬第七醫(yī)院2018~2021年病理送檢組織中診斷為芽生菌感染病例共15例，所選標本均經(jīng)4%中性緩沖甲醛溶液固定，常規(guī)脫水、透明、浸蠟和石蠟包埋，連續(xù)切片5張，切片厚度4~5μm。

2 染色方法

2.1 愛爾新藍染色（pH2.5）

常規(guī)切片，脫蠟至水后，愛先藍液（pH2.5）染15~20min，蒸餾水稍水洗，核固紅染3~5min，蒸餾水稍洗，常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片。

2.2 抗酸染色

常規(guī)切片, 汽油松節(jié)油混合液脫蠟至水后，滴入苯酚堿性品紅液于室溫染色30~40min，流水沖洗3~5min，20%硫酸分化1~2 min，流水沖洗3min，Mayer蘇木素復染1min，流水沖洗5min， 于56~60℃烤箱烘干，二甲苯透明、中性樹膠封片。

2.3 PAS染色

常規(guī)切片，脫蠟至水后，0.5%高碘酸氧化15min，蒸餾水沖洗1min，8%鉻酸氧化15min，蒸餾水洗1min，無色品紅液加蓋避光于42℃水浴箱中染5min，流水沖洗3min，Mayer蘇木素復染30s，返藍液返藍20s，流水沖洗1min，常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片。

2.4 六胺銀（PASM）染色

常規(guī)切片，脫蠟至水后， 8%鉻酸氧化30min，蒸餾水洗1min，1%偏重亞硫酸鈉水溶液1min，蒸餾水洗3min，入六胺液工作液于60℃水浴箱內40-60min，蒸餾水洗3min，0.1%氯化金調色2~3min，蒸餾水洗3min，3%硫代硫酸鈉處理3~5min，流水沖洗3min, 水溶性伊紅復染3~5 min，常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片。

結 果

在HE染色切片上，芽生菌呈圓形，棕褐色（圖1A）；PAS染色，細胞核藍色，芽生菌菌壁呈紅色（圖1B）；六胺銀染色顯示芽生菌菌壁呈黑色，背景為紅色（圖1C）；抗酸染色顯示細胞核藍色，個別數(shù)量芽生菌菌壁呈紅色，大多數(shù)菌壁不著色（圖1D）；愛爾新藍染色（pH2.5）顯示細胞核紅色，芽生菌菌壁不著色（圖1E）。

討 論

顯示真菌的染色方法很多，常用的有愛爾新藍染色（pH2.5）法、抗酸染色法、PAS染色法和六胺銀染色法。在這幾項顯示真菌的染色方法中， 尋找一種特異性高，操作簡便的方法顯示芽生菌至關重要。

顯示芽生菌，需要與隱球菌相鑒別，愛爾新藍染色（pH2.5）是顯示隱球菌的一種特異的方法，隱球菌愛爾新藍染色陽性，菌壁呈藍色，芽生菌愛爾新藍染色陰性，菌壁不著色。抗酸染色菌體壁多數(shù)陰性，少數(shù)個別菌體壁紅色，此方法特異性低，不能很好地把芽生菌顯示出來。PASM染色可以顯示芽生菌，但是從方法學上說，PASM整體實驗過程過于繁瑣，它需要于恒溫箱60℃加熱40~60min，染色反應時間總體偏長，提高溫度縮短反應時間也不易控制，且反應容易有銀離子沉淀析出，往往導致背景較深。從菌體顯示效果上分析，芽生菌的硬核小體圓形，厚壁，個別有分隔，PASM顯示芽生菌菌體分隔現(xiàn)象不明顯，過染還會使菌體成黑色實心圓球狀。為了讓菌體的厚壁及分隔現(xiàn)象能夠清晰地顯示出來，我們對傳統(tǒng)的PAS染色方法進行了改良，我們首先用0.5%的高碘酸氧化15min后，再用8%鉻酸氧化15min，不同試劑雙重氧化后得出的陽性結果更佳清晰，個別菌體容易觀察到明顯的分隔。傳統(tǒng)的PAS染色用時差異也較大，無色品紅放置時間的長短不同，實驗室溫度的高低不同，實驗反應的時間也是不同的，如夏季溫度高時無色品紅著染20min，冬季溫度低時無色品紅著染40min左右，這些種種因素都導致PAS整體實驗反應時間的不確定性。我們經(jīng)過一系列的實驗，長期摸索，把水浴箱溫度調整為42℃，玻片在無色品紅中反應5~7min，芽生菌的陽性結果定位清晰，菌壁四周深紅，個別菌體容易觀察到明顯的分隔，背景干凈最佳。

本實驗比較了4種特殊染色方法用于觀察病理組織中的芽生菌，結果顯示改良PAS染色法是檢測芽生菌的最佳染色方法，此方法著染的芽生菌菌壁最清晰，最容易辨認，菌體分隔現(xiàn)象容易觀察，值得在臨床病理工作中廣泛使用，我們在實際工作中可根據(jù)實際需要選用適合本實驗室的方法。