椰子水多糖的結(jié)構(gòu)和體外生物學(xué)活性分析

張玉鋒 ，郭玉如，溫遠(yuǎn)芬，宋菲，張有林*

1. 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所，國(guó)家重要熱帶作物工程技術(shù)中心（椰子研發(fā)部），海南省椰子深加工工程技術(shù)研究中心（文昌 571339）；2. 陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院（西安 710119）；3. 山西師范大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院（臨汾 041004）

椰子（Cocos nuciferaL.）因其在食品、能源、化工、建材等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，被熱區(qū)人民稱為“生命之樹”[1]。尤其是近來年，隨著椰子及其產(chǎn)品在預(yù)防和治療帕金森氏癥、心血管疾病、糖尿病和高血壓等疾病方面研究報(bào)道的增多[2]，世界范圍內(nèi)的椰子產(chǎn)品需求也逐年增長(zhǎng)。這也就意味著越來越多的副產(chǎn)物，如椰子水、椰殼、椰蓉的大量產(chǎn)生。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，海南省作為我國(guó)椰子主產(chǎn)區(qū)，年加工椰子超25億個(gè)，椰子水年產(chǎn)量超62.5萬 t[3]。這些椰子水除了少量用于發(fā)酵“納塔”外，大部分被丟棄到土壤或海洋中，不僅浪費(fèi)資源，也存在很大的環(huán)境污染風(fēng)險(xiǎn)。

研究表明，椰子水富含糖、維生素和礦物質(zhì)，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，是一種天然電解質(zhì)飲料[4-5]。同時(shí)，椰子水還被證實(shí)具有降血壓、降血脂、心臟保護(hù)、降血糖和肝保護(hù)等功效[6-7]，但是關(guān)于椰子水發(fā)揮功效的具體物質(zhì)基礎(chǔ)尚不清楚。此外，植物多糖因來源廣泛、活性突出等特點(diǎn)成為近年來食品和醫(yī)藥領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[8-10]。關(guān)于椰子水多糖結(jié)構(gòu)及功能活性相關(guān)的研究尚未見諸報(bào)道。因此，試驗(yàn)以椰子水為原料，提取制備多糖，分析其結(jié)構(gòu)特征，并評(píng)價(jià)其體外生物學(xué)活性，為椰子水在功能性食品和新藥資源領(lǐng)域的高值化利用提供數(shù)據(jù)支持，促進(jìn)海南椰子產(chǎn)業(yè)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

新鮮成熟椰子水（文昌東郊椰子加工廠）；巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、果糖、半乳糖醛酸（均為色譜級(jí)，純度＞98%，美國(guó)Sigma公司）；DMEM高糖培養(yǎng)基（含10% FBS、1%青鏈霉素）、二甲雙胍、胰蛋白酶、葡萄糖測(cè)定試劑盒（北京索萊寶生物科技有限公司）；過氧化氫、碳酸鈉、三氯乙酸、無水乙醇、硫酸、1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）等（均為分析純）。

UV-1600型紫外可見分光光度計(jì)[翱藝儀器（上海）有限公司]；DAWN HELEOS-II 18角度激光光散射儀（美國(guó)懷雅特公司）；Nicolet 67傅里葉紅外光譜儀（美國(guó)賽默飛世爾公司）；ICS-3000離子色譜儀（美國(guó)戴安公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 椰子水多糖的制備

采集后2 h內(nèi)的新鮮椰子水用4層紗布過濾，濾液在4 000 r/min離心10 min除雜，上清液于45 ℃真空濃縮至原體積的1/10；向濃縮液中加入等體積5%三氯乙酸溶液，于4 ℃靜置24 h；按4 000 r/min離心20 min取上清液，加入4倍體積的95%乙醇于4 ℃沉淀24 h；按4 000 r/min離心15 min取沉淀真空冷凍干燥，得到椰子水多糖，密封于-20 ℃保存，備用。

1.2.2 椰子水多糖的化學(xué)組成分析

椰子水多糖的主要化學(xué)成分包括中性糖、糖醛酸、蛋白質(zhì)和總酚，它們的含量分別用蒽酮-硫酸法[11]、咔唑-硫酸法[12]、考馬斯亮藍(lán)法[13]和福林酚法[11]測(cè)定，分別以葡萄糖、半乳糖醛酸、牛血清蛋白和沒食子酸（GAE）為對(duì)照做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 椰子水多糖的單糖組成

取10 mg樣品于水解管中，加入4.0 mL 4 mol/L三氟乙酸，充氮1 min排出管內(nèi)空氣，旋緊螺旋蓋，于120 ℃水解2 h，待冷卻后氮?dú)獯蹈伤庖海ミ^量的三氟乙酸，加超純水定容至10 mL。稀釋20倍后用0.2 μm濾膜過濾后，取20 μL濾液分析單糖組成。

色譜條件：流動(dòng)相A為水，流動(dòng)相B為250.0 mmol/L氫氧化鈉，流動(dòng)相C為1.0 mol/L乙酸鈉；流速0.5 mL/min；進(jìn)樣體積10 μL；柱溫35 ℃。

洗脫條件：0~20 min，94% A和6% B；20~20.1 min，89% A，6% B和5% C；20.1~35 min，74% A，6% B和20% C；35.1~45 min，20% A和80% B；45.1~55 min，94% A和6% B。

1.2.4 椰子水多糖的相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定

配制1 mg/mL的樣品溶液，過0.22 μm濾膜后，用測(cè)定多糖的相對(duì)分子質(zhì)量。

色譜條件：流動(dòng)相0.1 mol/L氯化鈉，流速0.5 mL/min，上樣量200 μL，柱溫25 ℃。

1.2.5 傅里葉紅外光譜（FIIR）分析

將樣品粉末與KBr混勻，壓成薄片，波數(shù)范圍為4 000~400 cm?1。

1.2.6 椰子水多糖的體外抗氧化活性測(cè)定

DPPH、ABTS和羥自由基清除能力分別參考李春陽(yáng)等[14]、Re[15]和莫開菊等[16]的方法測(cè)定，以抗壞血酸（VC）為陽(yáng)性對(duì)照。亞鐵離子螯合能力參考Torresfuentes等[17]的方法測(cè)定，并以乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）為陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.7 椰子水多糖對(duì)HepG2細(xì)胞活力及葡萄糖消耗的影響

參考王夢(mèng)雅等[18]的方法測(cè)定，并稍作修改。復(fù)蘇后的HepG2細(xì)胞用含有5%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基于37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每隔3 d用0.25%胰酶消化傳代。傳代3次后取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.7.1 細(xì)胞活力抑制率測(cè)定

取對(duì)數(shù)期細(xì)胞于96孔板，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/孔，設(shè)置終濃度2，20和50 μg/mL的多糖樣品組、不加樣品的正常對(duì)照組和二甲雙胍組（終濃度1×10-6moL/L，約0.17 μg/mL），于37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。棄上清液，每孔加入20 μL質(zhì)量濃度5 mg/mL的MTT溶液，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜（DMSO），用槍頭吹吸均勻，15 min后測(cè)定570 nm處的吸光度。

1.2.7.2 葡萄糖消耗試驗(yàn)

取對(duì)數(shù)期細(xì)胞于96孔板，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/孔，設(shè)置濃度2，20和50 μg/mL的多糖樣品組；不加樣品的DEME培養(yǎng)液為正常對(duì)照組；二甲雙胍組（終濃度1×10-6moL/L，約0.17 μg/mL）為陽(yáng)性對(duì)照組。在37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，按試劑盒說明書測(cè)定上清液中的葡萄糖含量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析和圖表制作采用Office 2007和Origin 8.5軟件，部分?jǐn)?shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 椰子水多糖的化學(xué)組成

化學(xué)成分結(jié)果顯示，椰子水多糖的中性糖含量達(dá)66.43%±1.78%，蛋白質(zhì)僅0.31%，說明多糖是提取樣品的最主要成分。糖醛酸含量為21.50%±0.75%，略低于枇杷葉多糖（糖醛酸含量28.82%~39.09%），表明椰子水多糖中也可能存在果膠樣酸性多糖[19]。另外，經(jīng)過除蛋白、乙醇沉淀和冷凍干燥等過程后，多糖中還結(jié)合有部分酚類物質(zhì)（4.61 mg GAE/g），說明椰子水多糖中可能存在少量的多糖-多酚共軛物[19]。

表1 椰子水多糖的化學(xué)組成

圖1 椰子水多糖的單糖組成色譜圖

進(jìn)一步利用離子色譜儀分析單糖組成后發(fā)現(xiàn)，椰子水多糖是一種雜多糖，主要由半乳糖、葡萄糖和木糖3種單糖組成，摩爾比為1.00∶10.30∶0.27。其中，葡萄糖為最主要單糖，1 mg/mL多糖水解液中的含量達(dá)194.40 μg/mL，其次為半乳糖（18.88 μg/mL）和阿拉伯糖（4.28 μg/mL）。未鑒定出半乳糖醛酸，推測(cè)椰子水多糖中可能含有其他糖醛酸組分，但仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

2.2 椰子水多糖的相對(duì)分子質(zhì)量

高效凝膠滲透色譜顯示，椰子水多糖相對(duì)分子質(zhì)量分布集中在主峰3（光散射檢測(cè)器下為2個(gè)色譜峰、示差信號(hào)中未完全分開）。但光散射信號(hào)顯示椰子水多糖由3個(gè)洗脫峰組成，而峰1和峰2在示差檢測(cè)器中幾乎檢測(cè)不出，可能為含量極少的高分子量聚集體[20]（圖2）。因此，為探究多糖與活性的構(gòu)效關(guān)系，可分離純化多糖純品。

圖2 椰子水多糖的高效凝膠滲透色譜圖

利用ASTRA5.3.4軟件計(jì)算椰子水多糖洗脫峰3的參數(shù)，如表2所示，重均分子質(zhì)量（MW）和數(shù)均分子質(zhì)量（Mn）分別為1.96×103g/moL和5.32×102g/moL，表明椰子水多糖為小分子聚合物。就多分散系數(shù)（Mw/Mn）來講，Mw/Mn值等于1時(shí)說明其相對(duì)分子質(zhì)量分布均勻；比值越大，則相對(duì)分子質(zhì)量分布越寬[21]。也即椰子水多糖的相對(duì)分子質(zhì)量分布較寬（Mw/Mn=3.68），這與高效凝膠滲透色譜中光散射檢測(cè)器的測(cè)定結(jié)果相吻合。

表2 椰子水多糖的分子參數(shù)

2.3 椰子水多糖的紅外光譜分析

紅外光譜顯示，椰子水多糖在3 200~3 400，2 800~3 000，1 400~1 600和800~1 200 cm-1有特征吸收峰。其中，3 288.52 cm-1代表O—H伸縮振動(dòng)，2 898.91 cm-1代表C—H伸縮振動(dòng)，而這2處吸收峰多為酸性多糖的特征吸收[22]；1 396.41 cm-1處的弱吸收進(jìn)一步證明羰基的存在[23]，這與多糖中含有糖醛酸的結(jié)果相吻合。1 577.72 cm-1代表N—H的彎曲振動(dòng)和[22]，說明多糖中含有蛋白質(zhì)組分。1 000~1 200 cm-1的強(qiáng)吸收，說明有吡喃糖的存在，尤其是921.94 cm-1處可歸納為β-吡喃結(jié)構(gòu)，829.36 cm-1則表示α-糖苷鍵的連接方式[24]。

圖3 椰子水多糖的紅外光譜

2.4 椰子水多糖的體外抗氧化活性

DPPH自由基是為數(shù)不多的穩(wěn)定自由基之一，可直接反映抗氧化劑的供氫能力[25]。由圖4可知，椰子水多糖對(duì)DPPH清除能力在低濃度范圍（0~0.25 mg/mL）內(nèi)隨濃度增加而增大，0.25 mg/mL時(shí)的清除率達(dá)67.72%，與5 μg/mL時(shí)VC的清除效果相當(dāng)（72.70%）；但繼續(xù)增加多糖濃度（0.25~0.5 mg/mL），其清除能力則無明顯增加趨勢(shì)，可能是椰子水多糖中供氫基團(tuán)含量較低的緣故。

圖4 椰子水多糖和維生素C對(duì)DPPH自由基的清除活性

羥自由基是已知的生物體內(nèi)活性和毒性最強(qiáng)的活性氧之一，它可以攻擊脂類、蛋白質(zhì)和核酸等幾乎所有的生物大分子，誘發(fā)氧化損傷[24-25]。椰子水多糖對(duì)羥自由基的清除能力呈劑量效應(yīng)，7.5 mg/mL時(shí)清除率達(dá)95.13%（圖5），略優(yōu)于Xu等[24]制備的黑醋栗多糖（對(duì)羥自由基的半清除濃度IC50為1.16 mg/mL），但仍弱于陽(yáng)性對(duì)照VC（0.35 mg/mL時(shí)清除率達(dá)99.45%）。

圖5 椰子水多糖和維生素C對(duì)羥自由基的清除活性

椰子水多糖和VC對(duì)ABTS自由基的清除能力均呈線性關(guān)系（圖6），擬合優(yōu)度（R2）均大于0.99。進(jìn)一步計(jì)算可得到椰子水多糖對(duì)ABTS自由基清除的IC50為2.10 mg/mL，顯著低于VC（IC50為13.89 μg/mL）（p＜0.05），但高于Liu等[26]通過冷凍和熱風(fēng)干燥制備的香菇酸性多糖（IC50分別為3.66 mg/mL和3.18 mg/mL）。這可能與椰子水多糖中含有較高的糖醛酸或多酚類物質(zhì)有關(guān)[27]。

圖6 椰子水多糖和維生素C對(duì)ABTS自由基的清除活性

亞鐵離子參與生物體內(nèi)的多個(gè)氧化還原反應(yīng)，如催化H2O2通過哈珀-維斯（Haber Weiss）反應(yīng)生成毒性更強(qiáng)的羥自由基，進(jìn)一步導(dǎo)致機(jī)體損傷。因此，螯合金屬離子也是反映物質(zhì)抗氧化能力的指標(biāo)之一。椰子水多糖對(duì)亞鐵離子的螯合能力在測(cè)試濃度范圍內(nèi)大致呈對(duì)數(shù)函數(shù)關(guān)系（R2=0.950 3），10 mg/mL時(shí)螯合率達(dá)89.74%。EDTA的螯合能力則表現(xiàn)為冪函數(shù)關(guān)系（R2=0.950 4），0.04 mg/mL時(shí)螯合率達(dá)94.93%。

圖7 椰子水多糖和EDTA對(duì)亞鐵離子的螯合能力

2.5 椰子水多糖對(duì)HepG2細(xì)胞活力及葡萄糖消耗的影響

圖8 椰子水多糖對(duì)HepG2葡萄糖消耗能力的影響

糖尿病作為一種慢性多發(fā)性疾病成為全球關(guān)注的公共衛(wèi)生問題，尋求安全高效的降糖資源成為食品和醫(yī)藥界的研究熱點(diǎn)之一。為探究椰子水多糖的降糖潛力，探究其對(duì)正常HepG2細(xì)胞活力和葡萄糖消耗作用的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在測(cè)試濃度（2，20和50 μg/mL）下，椰子水多糖對(duì)HepG2細(xì)胞活力均無抑制作用（結(jié)果未顯示）；并具有微弱的葡萄糖吸收促進(jìn)作用，20 μg/mL時(shí)消耗率增加4.81%，低于0.17 μg/mL二甲雙胍的促吸收效果。

3 結(jié)論

試驗(yàn)以椰子加工副產(chǎn)物為原料，制備椰子水多糖，并探究其化學(xué)組成、結(jié)構(gòu)特征、體外抗氧化以及其對(duì)HepG2細(xì)胞活力和葡萄糖消耗率的影響。結(jié)果表明，椰子水多糖中含有大量的糖醛酸（21.50%），是一種含有β-吡喃環(huán)結(jié)構(gòu)的酸性雜多糖。多糖分子的重均分子質(zhì)量為1.96×103g/moL，含有葡萄糖、半乳糖和木糖3種單糖。該多糖具有一定的體外抗氧化活性，0.25 mg/mL時(shí)其對(duì)DPPH自由基的清除率達(dá)67.72%；2.5 mg/mL時(shí)其對(duì)ABTS和羥自由基的清除率分別為60.72%和61.38%。椰子水多糖還能螯合亞鐵離子，5 mg/mL時(shí)的螯合率達(dá)71.37%。對(duì)HepG2消耗葡萄糖也有些許促進(jìn)作用，20 μg/mL時(shí)消耗率增加4.81%。研究結(jié)果為椰子水的深加工利用提供思路和借鑒。