分子印跡-LC-MS/MS測定谷物中吡氟草胺殘留量

王巖松，賀明睿*，王冬妍，閆曉梅，羅景陽，袁帥

1. 沈陽市食品藥品檢驗所（沈陽 110124）；2. 沈陽化工大學（沈陽 110142）

吡氟草胺屬于類胡蘿卜素生物合成抑制劑，是廣譜的選擇性麥田除草劑，施藥后抑制類胡蘿卜素的生物合成，使植物產(chǎn)生脫色現(xiàn)象，并間接地破壞光合作用，導致植物死亡[1]。吡氟草胺的毒性較強，在GB 2763—2019[2]中規(guī)定小麥中限量為0.05 mg/kg。目前，吡氟草胺的檢測方法主要有氣相色譜法[3]、液相色譜法[4-5]、氣質聯(lián)用法[6-7]和液相串聯(lián)質譜法[8-10]等。液相串聯(lián)質譜法具有靈敏度高、選擇性強，二級質譜掃描定量可以降低假陽性的誤判概率的優(yōu)點。

分子印跡技術[11-17]是模仿抗原-抗體原理而人工合成的對模板分子在空間結構和結合位點形成具有“記憶功能”的高分子聚合物（MIP）的技術。MIP的特異吸附性逐漸被發(fā)掘并應用于生物傳感器、化合物的提取、純化、色譜分離等領域。分子印跡固相萃取成功地將MIP的特性融入到固相萃取的技術中，為復雜基質中目標化合物的提取、分離尋找到新的解決途徑。

以吡氟草胺為模板分子，2-（三氟甲基）丙烯酸（TFMAA）為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）為交聯(lián)劑，偶氮二異丁腈（AIBN）為引發(fā)劑，成功制備了D-MIP，研制了吡氟草胺固相萃取小柱，應用于谷物中吡氟草胺殘留量的檢測。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

串聯(lián)質譜儀（API 4000，美國應用生物系統(tǒng)公司）；液相色譜儀（LC 20A，日本島津公司）；電子天平（BS244S，賽多利斯科學儀器有限公司）；電熱鼓風干燥箱（101-2，余姚市遠東數(shù)控儀器廠）；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（DF-101S，鞏義市英峪予華儀器制造廠）；臺式離心機（800-1，金壇區(qū)西城區(qū)新瑞儀器廠）；恒溫水浴振蕩器（SHA-B，國華企業(yè)）；電子萬用爐（DL-1，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）；數(shù)控超聲波清洗器（KQ5200DE，昆山市超聲儀器有限公司）；掃描電鏡（FEI NOVA NanoSEM 450，F(xiàn)EI公司）。

吡氟草胺（95%，沈陽化工研究院）；福美雙（98%，沈陽化工研究院）；無水乙醇（分析純，天津市大茂化學試劑廠）；TFMAA（98%，阿拉丁）；AIBN（98%，麥克林）；EGDMA（98%，阿拉丁）；鹽酸（分析純，國藥有限公司）；冰乙酸（分析純，天津市大茂化學試劑廠）；甲醇、乙腈（色譜純，美國Fisher公司）。

1.2 D-MIP的制備

準確稱取0.394 g 吡氟草胺于250 mL三角瓶中，加入100 mL乙腈至完全溶解后加入一定量的TFMAA室溫預聚12 h，依次加入5 mL EGDMA、0.5 mmol AIBN超聲5 min，持續(xù)充入氮氣10 min，封口，在60 ℃磁力攪拌24 h，取出制備的白色聚合物置于索氏提取器中，用60 mL無水乙醇-乙酸（8∶2，V/V）提取6 h，反復多次用甲醇-水（1∶1，V/V）超聲洗脫至洗脫液為中性，然后用甲醇洗脫，至LC-MS/MS檢測不到吡氟草胺分子為止，將聚合物置于60 ℃烘箱中烘干，得到吡氟草胺分子印跡聚合物，置于干燥器中備用。

非分子印跡聚合物（D-NIP）的制備步驟除不添加吡氟草胺，其余與D-MIP制備方法一致。

1.3 D-MIP的吸附性能測試

1.3.1 LC-MS/MS檢測的條件

Symmetry C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，3.5 μm）；流動相A為水，流動相B為甲醇，分別添加0.1%的甲酸；線性梯度洗脫程序：0~1.5 min為20% B，1.5~3 min由20% B變?yōu)?5% B，3~4.5 min為95% B，4.5~5 min由95% B變?yōu)?0% B，5~7 min保持20% B。流速0.35 mL/min，柱溫35 ℃，進樣體積10 μL。

電噴霧離子源（Electron spray ionization，ESI），正離子掃描；多反應監(jiān)測（Multiple reaction monitoring，MRM）；電噴霧電壓（Ionspray voltage，IS）5 500 V；霧化氣壓力65 psi（1 psi=6 894.76 Pa）；氣簾氣壓力15 psi；輔助氣壓力65 psi；離子源溫度550 ℃；定性離子對、定量離子對、碰撞氣能量（Collision energy，CE）及去簇電壓（Declustering Potential，DP）見表1。

表1 吡氟草胺、福美雙的質譜參數(shù)

1.3.2 吸附動力學試驗

準確稱取20 mg D-MIP和D-NIP，各7份，分別置于10 mL塑料離心管中，加入5 mL吡氟草胺溶液（10 mg/L）于30 ℃恒溫水浴振蕩。不同時間間隔同時取出1份D-MIP和D-NIP，離心后取100 μL上清液置于100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，取1 mL溶液過0.22 μm濾膜，供LC-MS/MS測定。以10，20，30，40，50，60和80 min時的吸附量Q與吸附時間t作圖，繪制吸附動力學曲線。吸附量按式（1）計算。

式中：Q為吸附量，μg/g；V為吡氟草胺標準溶液的體積，mL；C0為吡氟草胺的初始質量濃度，ng/mL；C1為吸附后吡氟草胺的質量濃度，ng/mL；W為D-MIP或D-NIP的質量，mg。

1.3.3 靜態(tài)平衡吸附試驗

準確稱取20 mg D-MIP和D-NIP，各6份，置于10 mL塑料離心管中，分別加入5 mL 2，4，6，8，10和12 μg/mL的吡氟草胺標準溶液，在30 ℃下恒溫振蕩50 min，然后離心，取100 μL上清液置于100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，取1 mL溶液過0.22 μm濾膜，供LC-MS/MS測定。以吸附量Q與吡氟草胺濃度C作圖，繪制等溫吸附曲線。

1.3.4 D-MIP選擇性吸附試驗

取2份20 mg D-MIP置于10 mL塑料離心管中，分別加入5 mL 10 μg/mL的吡氟草胺、福美雙水溶液，恒溫振蕩50 min，供LC-MS/MS測定。比較MIP對2種化合物的吸附性能。

1.4 D-MIP小柱的制備及驗收

1.4.1 D-MIP小柱的制備

D-MIP小柱的制備過程如圖1所示。去空柱裝入塞板1，加入100 mg的D-MIP，均勻覆蓋在塞板1表面，裝入塞板2確保聚合物厚度均勻一致后壓實，塞板平面必須與柱體垂直。

圖1 D-MIP小柱的裝柱過程

1.4.2 D-MIP柱容量和回收率試驗

D-MIP柱的活化：依次用5 mL甲醇-乙酸（9∶1，V/V）、5 mL水過柱活化。

取吡氟草胺質量濃度為1.0，2.0，5.0，10.0，15.0和20.0 μg/mL水溶液各10 mL，分別過活化后的6根D-MIP柱，用5 mL水淋洗和6 mL甲醇-乙酸（9∶1，V/V）洗脫，洗脫液稀釋至10~1 000 ng/mL質量濃度范圍后過0.22 μm有機濾膜，供LC-MS/MS定量分析。繪制上柱吡氟草胺標準物質的量與回收率曲線。當回收率低于80%時，上柱的量定為D-MIP凈化柱的柱容量（試驗在室溫下操作）。

1.5 D-MIP小柱在谷物中吡氟草胺殘留量檢測中的應用

1.5.1 提取

試驗選用大米、玉米、燕麥3種谷物樣品進行試驗。稱取500 g谷物樣品，經(jīng)粉碎機粉碎，過0.850 mm（20目）孔徑篩，混勻，密封，標記備用。稱取10.00 g粉碎樣品置于50 mL離心管中，加入5 g無水硫酸鈉，再加入10 mL乙腈振蕩30 min、超聲5 min，以10 000 r/min離心5 min，取上清液于50 mL離心管中，殘渣再用10 mL乙腈重復提取1次，合并上清液。上清液經(jīng)氮氣吹至近干，用5 mL水（1%甲酸）溶解待凈化。

1.5.2 凈化

提取液上活化后的D-MIP小柱凈化，經(jīng)5 mL水淋洗，6 mL甲醇-乙酸（9∶1，V/V）洗脫，洗脫液經(jīng)氮氣吹至近干，用1 mL甲醇定容，供LC-MS/MS定量分析。

1.5.3 方法學驗證

對采用D-MIP柱凈化的方法進行驗證，包括方法的靈敏度、線性關系、準確度、精密度等參數(shù)。

2 結果與討論

2.1 聚合反應條件對吸附性能的影響

2.1.1 聚合反應條件的確定

試驗優(yōu)化了致孔劑（乙腈）、功能單體（TFMAA）、交聯(lián)劑（EGDMA）和引發(fā)劑（AIBN）的用量及配比。100 mL乙腈中加入3 mmol/L TFMAA，在室溫預聚12 h，依次加入25 mmol/L EGDM和0.5 mmol/L AIBN，在60 ℃下聚合反應24 h。物料在上述比例及反應條件下，制得的聚合物產(chǎn)率最高，聚合物呈白色顆粒狀粉末，在圖2（a）中清晰可見聚合物呈空間立體網(wǎng)狀結構。

2.1.2 模板分子與功能單體的比例對吸附性能的影響

在保持上述聚合反應條件不變的情況下，改變模板分子的加入量，制得D-MIP的SEM圖。由圖2可知，當模板分子加入量的比例為1∶5時，制得的聚合物團聚在一起，沒有形成空間分散均勻的網(wǎng)狀結構，不利于模板分子的洗脫，影響聚合物吸附能力。隨著模板分子量的增加，聚合物的粒徑逐漸減小，呈現(xiàn)出空間的網(wǎng)狀結構，當模板分子的比例達到1∶3時，聚合物呈稀松的空間網(wǎng)狀結構，顆粒表面粗糙，顆粒之間形成大量的孔隙，推測適當比例的模板分子通過靜電吸附、氫鍵作用等在聚合物顆粒之間撐開較大的孔隙，形成大量的空間結合位點，模板分子被洗脫出去后在孔隙間留下具特異吸附性的結合位點。但是隨著模板分子的量繼續(xù)增加，聚合物顆粒表面變得光滑，粒徑增大，孔隙明顯減少，推測可能是模板分子相互作用降低了聚合物中形成孔穴的概率。因此，模板分子與功能單體的比例選擇1∶3。

圖2 不同比例模板分子與功能單體聚合物的SEM圖片（5 μm）

2.1.3 D-MIP的吸附性能

2.1.3.1 吸附動力學試驗結果

聚合物隨著吸附時間的增加，吸附在聚合物表面和孔隙間的吡氟草胺分子數(shù)量增多。如圖3所示：吸附時間在10~20 min之間，吸附速率最快；在20~50 min之間，吸附量以比較緩慢的速率持續(xù)增大；吸附時間增加到50 min時，吸附量達到飽和狀態(tài)；繼續(xù)延長吸附時間，吸附量還會出現(xiàn)略微的降低趨勢。在吸附前期，吡氟草胺分子迅速附著在聚合物顆粒表面，占據(jù)表面的結合位點，隨著時間的增加伴及振蕩作用，吡氟草胺分子緩慢地進入顆粒間的孔隙，通過具有“記憶功能”的結合位點，找到適合的位置。隨著時間繼續(xù)延長，到50 min時，聚合物表面和顆粒間的位點全部占據(jù)，聚合物達到最大吸附量，D-MIP最大吸附量為1 350 mg/kg，D-NIP最大吸附量為320 mg/kg。因為在D-NIP表面和顆粒間缺少了這種“記憶功能”的結合位點，其吸附量明顯低于D-MIP。

圖3 D-MIP和D-NIP對吡氟草胺的吸附動力學曲線

如圖4所示，D-NIP和D-MIP在放大倍數(shù)逐漸增大的情況下，能更清晰發(fā)現(xiàn)D-NIP顆粒粒徑明顯大于D-MIP顆粒粒徑，圖4（f）中可以看到D-MIP顆粒表面凸凹不平，顆粒間均勻分布大量的孔隙，正因為D-MIP顆粒表面的凸凹結構和孔隙，賦予了它良好的吸附性能和特異選擇性。聚合物顆粒的結構分布情況進一步證明D-MIP吸附量明顯大于D-NIP。

圖4 不同分辨率D-NIP和D-MIP的SEM圖片

2.1.3.2 靜態(tài)吸附試驗結果

保持50 min的吸附時間，驗證聚合物在不同濃度吡氟草胺標準溶液中吸附量變化。如圖5所示，D-MIP和D-NIP均表現(xiàn)出隨著吸附吡氟草胺濃度的升高，吸附量變大的趨勢。D-NIP的吸附曲線比較平穩(wěn)，沒有出現(xiàn)吸附量突越的現(xiàn)象，D-MIP結構中印跡孔隙和具有特異吸附性的識別位點與吡氟草胺濃度相匹配，吡氟草胺分子在D-MIP顆粒表面和空隙中迅速占位，當其質量濃度達到8 μg/mL時吸附行為達到終點，最大吸附量為1 350 mg/kg。X-NIP依靠自身的縫隙和疏松的結構也存在一定的吸附行為，飽和吸附量為320 mg/kg。

2.1.3.3 選擇性吸附試驗結果

在相同的試驗條件下，比較D-MIP對吡氟草胺和福美雙分子的吸附能力。結果顯示：D-MIP對吡氟草胺的吸附量明顯高于福美雙，為1 350 mg/kg；其對福美雙的吸附量為350 mg/kg。再次證明D-MIP結構中形成的“記憶”孔隙和識別位點只與吡氟草胺分子相匹配，與福美雙的分子結構不具有識別功能。

2.2 D-MIP凈化柱性能試驗結果

凈化柱的柱容量是指凈化柱對一種或多種溶質可容納的最大量。試驗比較D-MIP凈化柱中D-MIP粉末的裝柱質量對吸附性能的影響。當裝柱質量較少時，柱容量較低，在淋洗過程容易損失目標物，限制小柱的應用。D-MIP粉末的裝柱質量也不宜過多，否則會導致目標物不易洗脫出來，增加甲醇的用量。綜合考慮，D-MIP粉末的裝柱質量選擇100 mg。

試驗選用吡氟草胺質量濃度為1.0，2.0，5.0，10.0，15.0和20.0 μg/mL水溶液各10 mL分別過D-MIP凈化柱，經(jīng)LC-MS/MS定量分析，計算不同濃度點的回收率，結果如圖5所示。當吡氟草胺上柱量在100 μg以下時，回收率保持在90%以上；當上柱量超過135 μg時，回收率降低至80%以下。為保證凈化柱的良好性能，確定100 μg為D-MIP凈化柱的柱容量。

圖5 D-NIP和D-MIP的靜態(tài)吸附曲線

圖6 吡氟草胺溶液過柱后的回收率

2.3 D-MIP凈化柱在谷物中吡氟草胺檢測方法中的應用

將分子印跡固相萃取小柱用于大米、玉米和燕麥等谷物樣品中吡氟草胺殘留量的檢測，優(yōu)化前處理條件和D-MIP凈化柱的活化、淋洗和洗脫等步驟。色譜條件和質譜條件按照1.3.1節(jié)。吡氟草胺和福美雙質量濃度為10 μg/L的MRM色譜圖如圖7所示。

圖7 吡氟草胺與福美雙的MRM色譜圖

由表2可知，3種基質中吡氟草胺的定量限均為0.1 μg/kg，在0.1~20 μg/kg線性范圍內線性關系良好，線性關系系數(shù)r≥0.999 0。當3種基質中的添加濃度分別為0.1，0.5和5 μg/kg時，其平均回收率在89.6%~102.9%之間（n=6），平均精密度SRSD為4.41%。

表2 不同基質中吡氟草胺的相對回收率、精密度和線性關系試驗結果（n=6）

3 結論

試驗采用本體聚合法，乙腈為致孔劑，TFMAA為功能單體，EGDMA為交聯(lián)劑，AIBN為引發(fā)劑，制備吡氟草胺的分子印跡聚合物，D-MIP的最大吸附量為1 350 mg/kg。應用D-MIP研制出分子印跡固相萃取小柱，凈化柱具有較好的吸附性能，柱容量達到100 μg/100 mg。

應用D-MIP凈化柱，建立谷物中吡氟草胺殘留量的檢測方法。該方法具有較高的靈敏度，定量限為0.1 μg/kg。當大米、玉米和燕麥基質中的添加濃度分別為0.1，0.5和5 μg/kg時，其平均回收率在89.6%~102.9%之間（n=6），平均精密度SRSD為4.41%，該方法具有較高的精密度和準確度。