鐵皮石斛多糖提取工藝

林君，何秋杰，趙琤，黃友琴*

廣西農業(yè)職業(yè)技術學院（南寧 530007）

鐵皮石斛屬多年生附生草本植物[1]，是我國傳統(tǒng)的珍稀藥材，名列“中華九大仙草”之首[2]。現(xiàn)研究證實，鐵皮石斛具有滋陰潤肺、養(yǎng)胃生津、健腦明目等神奇功效[3]，可用于治療熱病津傷、口干煩渴、陰虛火旺等多種病癥[4]。

鐵皮石斛主要含多糖、生物堿、氨基酸和微量元素等化學成分[5]，其中多糖含量相較其他石斛屬植物更高，是生物體內一類重要有機高分子化合物[6]，是維持生命活動的四大基礎物質之一[7]。我國對多糖的研究起步較晚，始于20世紀70年代，但發(fā)展迅速，并成為現(xiàn)代藥理學研究的新熱點[8]。鐵皮石斛多糖有多種提取方法，如水提法和酶解法。水提法是最常用的方法，而酶解法因酶對鐵皮石斛中游離蛋白質具有水解作用，提取液中只含少量蛋白質，同時降低了它們與原料的結合力，有利于多糖的浸出，所以酶解法也是一種理想的提取方法[9-10]。

采取水提法和酶解法2種方法提取鐵皮石斛多糖，考察提取時間、提取溫度和料液比等多因素對多糖獲得率的影響，得到多糖的最佳提取工藝，為鐵皮石斛多糖的開發(fā)和利用提供參考，對于帶動鐵皮石斛深加工產業(yè)的發(fā)展、拓寬其利用途徑、增加其附加值、提高經濟效益、帶動農民致富具有重要作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葡萄糖（分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司）；苯酚（分析純，天津市福晨化學試劑廠）；濃硫酸（優(yōu)級純）；所有分離用有機溶劑均為國產分析純。

可見分光光度計（VIS-7220N，北京瑞利分析儀器有限公司）；數顯恒溫水浴鍋（HHS，江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠）；電子天平（PL203，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；快速超聲波提取器（GDYQ-705S，長春吉大小天鵝儀器有限公司）；電熱恒溫鼓風干燥箱（DHG-9246，上海精宏實驗設備有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（HWS-24，上海齊欣科學儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 鐵皮石斛多糖提取工藝

鐵皮石斛→清洗→烘干→粉碎→浸提

1.2.2 操作要點鐵皮石斛清洗：選取無病蟲害、無機械傷、無腐敗變質的新鮮鐵皮石斛，用清水洗干凈，去除表面的污物及雜質。

烘干：將洗干凈的鐵皮石斛用80 ℃溫度進行烘干。

粉碎：烘干的鐵皮石斛切成小段，用粉碎機粉碎，用0.180 mm孔徑篩過篩成鐵皮石斛粉末。

浸提：把鐵皮石斛粉末用不同的料液比、不同的浸提溫度、不同的浸提時間進行浸提。

1.2.3 硫酸-苯酚法測定鐵皮石斛多糖

1.2.3.1 配制標準葡萄糖溶液

準確稱取1 g干燥至恒重的葡萄糖，用蒸餾水定容至1 000 mL，搖勻后吸取10 mL用蒸餾水稀釋定容至250 mL，該溶液每毫升相當于含0.04 mg葡萄糖。

1.2.3.2 制作葡萄糖標準曲線

分別吸取0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6和1.8 mL標準葡萄糖（0.04 mg/mL）溶液于比色管，加蒸餾水至2.0 mL，加入1.0 mL 6%苯酚及5.0 mL濃硫酸，搖勻冷卻，沸水浴顯色15 min后于490 nm波長測定其吸光度，得葡萄糖標準曲線，葡萄糖溶液質量濃度與吸光度的線性關系為y=14.824x-0.002 2（R2=0.999 7）。

圖1 葡萄糖標準曲線

1.2.3.3 多糖提取率的計算

稱取3 g鐵皮石斛粉末于100 mL容量瓶中浸提，過濾得過濾液，吸取5 mL過濾液于100 mL容量瓶中定容，吸取1 mL樣品溶液于試管中，加入1.0 mL蒸餾水，再加入1 mL 6%苯酚溶液和5 mL濃硫酸溶液，顯色測其吸光度。與葡萄糖標準曲線比較算出多糖含量。采用稱重法測定鐵皮石斛多糖的提取率[9]，按式（1）計算。

2 結果與分析

2.1 水浸提法提取鐵皮石斛多糖單因素試驗

2.1.1 不同浸提溫度對鐵皮石斛多糖提取率的影響

稱取3 g鐵皮石斛粉末，各5份，加水溶解定容至100 mL容量瓶中，分別在50，60，70，80和90 ℃的水浴鍋中恒溫加熱4 h，冷卻后過濾，吸取5 mL過濾液放入100 mL容量瓶中稀釋定容，吸取1 mL樣品稀釋溶液于試管中，依次加入1.0 mL蒸餾水，1 mL 6%苯酚溶液和5 mL濃硫酸溶液，顯色測其吸光度，與標準葡萄糖比較算出不同浸提溫度提取鐵皮石斛多糖的提取率，結果見表1。

表1 不同浸提溫度對鐵皮石斛多糖提取率的影響

由圖2可看出，浸提溫度50~80 ℃時鐵皮石斛多糖提取率隨溫度升高而增大，超過80 ℃后，隨著溫度升高，提取率又呈緩慢下降的趨勢，分析其原因可能是溫度過低時，其對多糖物質的析出不利，溫度過高時，析出的多糖又會在高溫情況下降解。故最佳浸提溫度為80 ℃，此時鐵皮石斛多糖提取率為2.3%。

圖2 不同浸提溫度對鐵皮石斛多糖提取率的影響

2.1.2 不同料液比浸提對鐵皮石斛多糖提取率的影響

稱取3 g鐵皮石斛粉末，各5份，分別以1∶20，1∶25，1∶30，1∶35和1∶40（g/mL）的料液比在80℃水浴鍋中恒溫加熱浸提4.5 h，冷卻后過濾，吸取5 mL過濾液于100 mL容量瓶中稀釋定容，吸取1 mL樣品稀釋液于試管中，依次加入1.0 mL蒸餾水，1 mL 6%苯酚溶液和5 mL濃硫酸溶液，顯色測其吸光度，與標準葡萄糖比較算出不同料液比提取鐵皮石斛多糖的提取率，結果見表2。

表2 不同料液比提取對鐵皮石斛多糖提取率的影響

由圖3可看出，隨著料液比中加水量增大，鐵皮石斛多糖提取率呈上升趨勢，但超過1∶35（g/mL）時，提取率呈下降趨勢。故1∶35（g/mL）為最佳的浸提料液比，此時鐵皮石斛多糖提取率為2.2%。

圖3 不同料液比提取對鐵皮石斛多糖提取率的影響

2.1.3 不同浸提時間對鐵皮石斛多糖提取率的影響

稱取3 g鐵皮石斛粉末，各5份，溫度80 ℃，料液比1∶35（g/mL），分別浸提3.5，4.0，4.5，5.0和5.5 h，冷卻后過濾，吸取5 mL過濾液放入100 mL容量瓶中稀釋定容，吸取1 mL樣品稀釋溶液于試管中，依次加入1.0 mL蒸餾水，1 mL 6%苯酚溶液和5 mL濃硫酸溶液，顯色測其吸光度，與標準葡萄糖比較算出不同浸取時間提取鐵皮石斛多糖的提取率，結果見表3。

表3 不同提取時間對鐵皮石斛多糖提取率的影響

由圖4可看出，在3.5~4.5 h時，隨提取時間延長，鐵皮石斛多糖提取率逐漸升高，但4.5 h之后又逐漸下降，在一定時間范圍內，多糖提取率會隨著時間延長而提高，但多糖成分已完全溶出后，繼續(xù)延長提取時間，并不能提高提取率，反會有增加提取液中雜質含量的可能性。故提取時間選擇4.5 h，此時鐵皮石斛多糖提取率為3.5%。

圖4 不同提取時間對鐵皮石斛多糖提取率的影響

2.2 水浸提法提取鐵皮石斛多糖正交試驗

在單因素試驗的基礎上，選取溫度、時間和料液比進行三因素三水平正交試驗，結果見表4和表5。

表4 正交試驗表L9(33)

由表5可知，試驗結果表明不同的因素對提取率均有影響，其中3個因素對多糖提取率影響最大的是提取時間，其次是料液比，提取溫度的影響最小。從試驗結果看來，以提取率為指標，確定最佳提取工藝條件A1B1C3，即提取時間4 h、提取溫度70 ℃、料液比1∶40（g/mL），此條件下鐵皮石斛多糖提取率可達2.7%。在上述試驗結果中與最佳提取率相近的是試驗2。

表5 L9(33)正交試驗結果

2.3 酶（果膠酶）解法提取鐵皮石斛多糖單因素試驗

2.3.1 不同酶解溫度對鐵皮石斛多糖提取率的影響

稱取5份1 g鐵皮石斛粉末，溶解定容至100 mL容量瓶中，分別在30，40，50，60和70 ℃水浴鍋中恒溫加熱4 h，冷卻后過濾，吸取10 mL過濾液放入100 mL容量瓶中稀釋定容，吸取1 mL于試管中，依次加入1.0 mL蒸餾水，1 mL 6%苯酚溶液和5 mL濃硫酸溶液，顯色測其吸光度，與標準葡萄糖比較算出鐵皮石斛多糖的提取率，結果見表6和圖5。

表6 不同酶解溫度對鐵皮石斛多糖提取率的影響

由圖5可知，酶解溫度30~50 ℃時，提取率呈上升趨勢，達到50 ℃時，提取率最高，60~70 ℃時提取率逐漸下降，溫度過高時，其對多糖的析出可能受影響，酶也會失活。故多糖提取最適的溫度為50 ℃，此時提取率為2.7%。

圖5 不同酶解溫度對鐵皮石斛多糖提取率的影響

2.3.2 不同酶解時間對鐵皮石斛多糖提取率的影響

稱取5份1 g鐵皮石斛粉末，溶解定容至100 mL容量瓶中，以溫度50 ℃，酶解時間分別為2.0，2.5，3.0，3.5和4.0 h，在水浴鍋中恒溫加熱進行浸提，拿出冷卻過濾，吸取10 mL過濾液放入100 mL容量瓶中稀釋定容，吸取1 mL樣品溶液于試管中，依次加入1.0 mL蒸餾水，1 mL 6%苯酚溶液和5 mL濃硫酸溶液，顯色測其吸光度，與標準葡萄糖比較算出鐵皮石斛多糖的提取率，結果見表7和圖6。

表7 不同酶解時間對鐵皮石斛多糖提取率的影響

由圖6可知，酶解時間2.0~3.5 h時，多糖提取率不斷增高，達到最高點時，提取率又開始逐漸呈下降趨勢，所以在一定時間范圍內，多糖會隨著時間延長而提高，多糖完全溶出后，繼續(xù)增加提取時間，可能會增加提取液中雜質含量的可能性。故最適酶解時間為3.5 h，此時提取率為2.8%。

圖6 不同酶解時間對鐵皮石斛多糖提取率的影響

2.3.3 不同酶用量對鐵皮石斛多糖提取率的影響

稱取1 g鐵皮石斛粉末，各5份，于100 mL容量瓶中，酶用量分別為0.04%，0.05%，0.06%，0.07%和0.08%，加水定容后在50 ℃水浴鍋中恒溫加熱浸提3.5 h，冷卻后過濾，吸取10 mL過濾液放入100 mL容量瓶中稀釋定容，吸取1 mL樣品溶液于試管中，依次加入1.0mL蒸餾水，1 mL 6%苯酚溶液和5 mL濃硫酸溶液，顯色測其吸光度，與標準葡萄糖比較算出鐵皮石斛多糖的提取率，結果見表8和圖7。

表8 不同酶用量對鐵皮石斛多糖提取率的影響

圖7 酶解法酶用量對多糖提取率的影響

由圖7可知，酶用量0.04%~0.07%時，鐵皮石斛多糖提取率呈上升趨勢，酶用量達到0.07%時，鐵皮石斛多糖的提取率最高，酶用量達到0.07%之后，鐵皮石斛多糖提取率又開始逐漸下降，故最適酶用量為0.07%，此時提取率達2.4%。

2.4 酶提法提取鐵皮石斛多糖正交試驗

在單因素試驗基礎上，選取酶用量、酶解溫度和酶解時間進行三因素三水平正交試驗，結果見表9和表10。

表9 正交試驗表L9(33)

由表10可知，不同因素對提取率均有影響，其中3個因素對多糖提取率影響最大的是酶用量，其次是酶解溫度，影響最小的是酶解時間，在試驗結果中以提取率為指標，確定最佳提取工藝條件為A1B3C1，即酶用量0.06%、提取溫度60 ℃、提取時間3 h，在此最佳條件下鐵皮石斛多糖提取率可達2.7%，鐵皮石斛多糖的提取率最佳，與最佳組合交相近的試驗是試驗3。

表10 L9(33)正交試驗結果

3 結論

試驗結果表明：（1）在水浸提法的單因素試驗優(yōu)化鐵皮石斛多糖的提取工藝中，提取時間對鐵皮石斛多糖的提取影響最大。應用分析法優(yōu)化鐵皮石斛多糖提取工藝，同時考慮實際生產中的能耗活性保持的問題，通過正交試驗得到鐵皮石斛多糖提取的最佳工藝參數為提取時間4 h、提取溫度70 ℃，料液比1∶40（g/mL），此條件下鐵皮石斛多糖提取率最高可達2.7%。（2）在酶解法的單因素試驗優(yōu)化鐵皮石斛多糖的提取工藝中，酶用量對鐵皮石斛多糖的提取影響最大。通過正交試驗得到鐵皮石斛多糖提取的最佳工藝參數為酶用量0.06%、提取溫度60 ℃、提取時間3 h，此條件下的鐵皮石斛多糖提取率最高可達2.7%。（3）由正交試驗可知水浸提法與酶解法對鐵皮石斛多糖提取最高均可達2.7%，但從省時方面比較，優(yōu)先使用酶解法。