天麻總酚閃式提取工藝研究及含量測定

楊云，蔡朝霞*

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院（武漢 430070）

天麻（Gastrodia elata）是蘭科天麻屬多年生草本寄生植物，主產(chǎn)于我國云南、貴州、四川等地，其中云南昭通和貴州畢節(jié)的天麻堪稱為道地藥材。天麻塊莖在我國已經(jīng)有2 000多年的藥用歷史，是重要的藥食兩用材料，具有息風(fēng)止痙、平抑肝陽、祛風(fēng)通絡(luò)的功效，可用于治療小兒驚風(fēng)、癲癇抽搐、頭痛眩暈、肢體麻木等病癥[1]。天麻具有豐富的酚性成分，除天麻素（4-羥甲基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷）是天麻的主要有效成分之外，還包括對(duì)羥基芐醇、對(duì)羥基苯甲醛、4-羥基苯甲醇、香草醛、香蘭素等酚類化合物[2-7]。天麻素和對(duì)羥基苯甲醇含量是《中國藥典》2015年版中天麻質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定的重要的參考指標(biāo)。文獻(xiàn)報(bào)道，抗氧化、抑制早期炎癥反應(yīng)、減輕腦缺血損傷、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的活性作用是天麻酚性成分共同作用的結(jié)果，因此使用天麻總酚含量作為評(píng)價(jià)天麻質(zhì)量的指標(biāo)或更為全面。

天麻酚類成分的傳統(tǒng)提取方法以水煎煮為主，其他提取方法有酶法、超聲法、超高壓等[8]。孫海燕[3]采用超聲法提取天麻總酚的含量，得到的總酚含量為5.62 mg/g；朱素英[9]采用57%的乙醇水浴提取天麻總酚，得到的總酚含量達(dá)44.96 mg GAE/g；田孟華等[2]采用40%乙醇超聲提取得到天麻總酚含量為4.47 mg/g。丁慧等[10]采用82%的乙醇，使用超高壓技術(shù)提取天麻中天麻素和對(duì)羥基苯甲醇的含量為718.69 μg/g。但是上述提取方法多存在提取時(shí)間長、有機(jī)溶劑使用多、對(duì)設(shè)備要求高等缺陷。閃式提取器[11]是根據(jù)組織破碎原理而設(shè)計(jì)的一種新型提取器，它將高速組織粉碎機(jī)和勻漿機(jī)等機(jī)械設(shè)備優(yōu)勢很好地結(jié)合在一起，被廣泛應(yīng)用于中草藥及其他植物成分的提取。利用高速液體破碎、高速研磨、高速攪拌和超分子滲濾技術(shù)，在常溫液體狀態(tài)下數(shù)秒至幾分鐘內(nèi)把植物組織破碎、研磨至細(xì)微顆粒狀，通過細(xì)胞組織的破裂和組織外圍溶劑的快速滲透與包容，使組織內(nèi)有效成分分子迅速解離并進(jìn)入到溶劑體系中，并迅速實(shí)現(xiàn)藥材組織內(nèi)外有效成分分子濃度的平衡，達(dá)到快速提取的效果。此次試驗(yàn)以天麻粗粉為原料，使用中草藥組織破碎提取機(jī)器，研究天麻總酚的閃式提取工藝，并與煎煮法、超聲乙醇提取法和水浴提取法得到總酚的含量進(jìn)行比較研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)器材

中草藥組織破碎提取器（ATS-150012A，北京金鼐科技發(fā)展有限公司）；高速萬能粉碎機(jī)（FW100，天津市泰斯特儀）；電子分析天平（BSA124S，賽多利斯茵泰科公司）；紫外分光光度計(jì)：Nanodrop 2000C，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（SIGMA 3-30K，德國西格瑪離心機(jī)公司）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-2，常州國華電器有限公司）；超聲波內(nèi)頻清洗機(jī)（SD-500DTY，寧波新芝生物科技有限公司）。

1.1.2 材料

天麻飲片由武漢健民有限公司提供，產(chǎn)地是云南昭通。

1.1.3 試劑

無水乙醇（AR）；Folin-酚試劑（AR），廣州飛揚(yáng)生物工程有限公司；無水碳酸鈉（AR），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99%），上海源葉生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總酚測定方法

采用Folin-酚比色法，參考文獻(xiàn)[3]的方法并略做修改。精密稱取0.500 0 g沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中，用水定容至刻度；準(zhǔn)確吸取0.0，0.1，0.2，0.3，0.5和1.0 mL上述溶液并分別定容至10 mL，另取6支試管，分別吸取0.1 mL上述溶液，各加5 mL水，混合，加入0.5 mL Folin-酚試劑，振蕩混勻后；反應(yīng)6 min后，加入1.5 mL 20%碳酸鈉溶液，混合均勻后加入水定容至10 mL，在37 ℃水浴中避光靜置30 min，在765 nm波長下測定其吸光度，以沒食子酸質(zhì)量濃度x為橫坐標(biāo)，吸光度y為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程y=0.678 9x+0.055 1（R2=0.999），在0.00~0.50 mg/mL范圍內(nèi)，吸光度與質(zhì)量濃度線性關(guān)系良好。根據(jù)吸光度和標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算樣品中總酚含量。天麻總酚含量（Y，mg GAE/g）按式（1）計(jì)算。

式中：C為天麻總酚質(zhì)量濃度，mg/mL；v為提取液定容后的體積，mL；m為天麻樣品的質(zhì)量，g。

1.2.2 單因素試驗(yàn)

以不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇作為提取溶劑，準(zhǔn)確稱取過20目篩（850 μm）的天麻樣品粉，參考文獻(xiàn)[12-15]和已有試驗(yàn)工作基礎(chǔ)上，以提取時(shí)間、料液比和乙醇體積分?jǐn)?shù)3個(gè)因素的水平值為研究對(duì)象。在提取時(shí)間4 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)0的條件下進(jìn)行閃式提取，提取料液比分別為1∶40，1∶45，1∶50，1∶55和1∶60（g/mL），考察提取料液比對(duì)天麻中總酚得率的影響；在提取料液比1∶45（g/mL）、提取時(shí)間4 min的條件下進(jìn)行閃式提取，乙醇體積分?jǐn)?shù)設(shè)定為0，20%，40%，60%和80%，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)天麻總酚得率的影響；在提取料液比1∶45（g/mL）、乙醇體積分?jǐn)?shù)0的條件下進(jìn)行閃式提取，提取時(shí)間分別為1，2，3，4和5 min，考察提取時(shí)間對(duì)天麻總酚得率的影響。提取液均經(jīng)8 000 r/min離心15 min，吸取0.2 mL上清液，按1.2.1小節(jié)方法進(jìn)行檢測。

1.2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素的基礎(chǔ)上，應(yīng)用SPSS 21.0軟件，設(shè)計(jì)三因素三水平的正交優(yōu)化試驗(yàn)，以天麻提取液中總酚得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定閃式提取天麻總酚的最佳提取條件。正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 天麻總酚閃式提取工藝正交試驗(yàn)因素水平

1.2.4 天麻總酚提取方法的比較研究

取3份經(jīng)粉碎過20目篩（850 μm）的天麻樣品粉，分別4種提取方法提取天麻總酚。其中，60 ℃水浴提取條件為料液比1∶30（g/mL）、提取時(shí)間2 h；閃式提取條件為提取時(shí)間2 min、料液比1∶40（g/mL），純水提?。怀曁崛l件為料液比1∶10（g/mL）、提取時(shí)間2 h、70%乙醇的提取溶劑；煎煮法條件為8倍水提取、提取時(shí)間2 h。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 提取時(shí)間的影響

由圖1可知，在1~5 min，天麻提取液中總酚得率隨著提取時(shí)間的延長而增加。提取時(shí)間大于3 min之后，提取液中總酚得率下降，推測可能是由于提取時(shí)間延長導(dǎo)致天麻細(xì)胞破壁，淀粉等成分溶出與水接觸，阻礙了酚類成分的溶出，或是提取液溫度的上升導(dǎo)致多酚類物質(zhì)的氧化加快，從而導(dǎo)致總酚得率下降。

圖1 提取時(shí)間對(duì)天麻總酚提取的影響

2.1.2 料液比的影響

由圖2可知，料液比在1∶40~1∶55（g/mL）范圍內(nèi)，天麻提取液中總酚得率之間沒有顯著性（p＞0.05）。當(dāng)料液比達(dá)到1∶60（g/mL）時(shí)，天麻提取液中多酚得率有顯著降低。顆粒物料處于合適的溶液體積范圍內(nèi)，提取料液比的增加對(duì)天麻總酚成分溶出沒有明顯差別，但隨著提取溶劑的體積繼續(xù)增加，總酚得率下降。

圖2 料液比對(duì)天麻總酚提取的影響

2.1.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響

由圖3可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)在0~80%范圍內(nèi)，天麻提取液中總酚得率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高而減少，乙醇體積分?jǐn)?shù)為0和20%時(shí)，提取液中總酚得率幾乎相近，沒有顯著性（p＞0.05）。但隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增加（20%~80%），天麻總酚含量開始下降。推測原因是天麻素等酚性成分是水溶性的，但天麻屬于根莖類藥材，含有淀粉和多糖類成分，水提液雜質(zhì)較多，對(duì)后續(xù)提純處理帶來很大困難，所以選擇乙醇作為提取溶劑，但是高體積分?jǐn)?shù)的乙醇會(huì)導(dǎo)致一些醇溶性雜質(zhì)或者是脂溶性強(qiáng)的成分溶出增加，這些物質(zhì)的溶出導(dǎo)致酚類成分從顆粒物料中的溶出減少，所以采用低體積分?jǐn)?shù)乙醇作為天麻中天麻素等酚類成分的提取溶劑較為合適。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)天麻總酚提取的影響

2.2 正交試驗(yàn)

由表2中R值可知，因素A（提取時(shí)間）對(duì)閃式提取影響最大，各因素對(duì)總酚提取的影響順序?yàn)锳＞C＞B。但方差分析顯示三因素對(duì)閃式提取的影響均不顯著，再考慮到天麻水提液雜質(zhì)較多，故采用乙醇作為提取溶劑，且采用低體積分?jǐn)?shù)乙醇作為天麻中天麻素等酚類成分的提取溶劑較為合適。因此，最佳提取因素的組合為A1B1C2，即提取時(shí)間2 min，料液比1∶40 g/mL，乙醇體積分?jǐn)?shù)20%。

表2 天麻總酚閃式提取正交試驗(yàn)表及結(jié)果分析

準(zhǔn)確稱取3份粉碎過20目篩（850 μm）的天麻樣品粉，按照最佳提取組合條件進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)，結(jié)果顯示提取液總酚的平均含量為35.25 mg GAE/g，與優(yōu)化試驗(yàn)中含量最高提取條件組的很接近，說明優(yōu)化后的最佳提取條件穩(wěn)定性很高。

表3 天麻總酚閃式提取方差分析表

2.3 天麻總酚提取方法的比較

將閃式提取方法與文獻(xiàn)報(bào)道的3種天麻總酚提取方法進(jìn)行比較研究，提取結(jié)束后分別測定提取液的天麻總酚得率，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，4種方法提取天麻總酚的效率不同，差異較大，以閃式提取法的提取率最高，煎煮法的最低。閃式提取法的提取率較煎煮法的提高了129.40%，較60 ℃水浴提取、超聲提取分別提高了82.26%和31.20%。對(duì)于天麻總酚提取而言，煎煮法和水浴提取時(shí)間長，超聲提取消耗乙醇等有機(jī)溶劑；而閃式提取法提取時(shí)間短，而且能夠最大限度地保護(hù)提取總酚的活性，提取效率高，密閉環(huán)境操作，安全系數(shù)高。

圖4 4種提取方法提取天麻總酚得率的比較

3 結(jié)論

閃式提取器具有高速攪拌、高速破碎、高速研磨、高速勻漿的優(yōu)點(diǎn)，在中藥材等植物提取物領(lǐng)域適用性強(qiáng)，適合植物根、莖、葉、花等軟硬材料的快速提取。此次試驗(yàn)運(yùn)用閃式提取法提取天麻總酚，其最佳提取工藝條件為提取時(shí)間2 min、料液比1∶40（g/mL）、乙醇體積分?jǐn)?shù)20%，在此條件下天麻提取液中總酚得率達(dá)到35.25 mg GAE/g。與傳統(tǒng)煎煮法相比較，該方法提取時(shí)間大大縮短，耗費(fèi)機(jī)械功率減低，是一種節(jié)能高效的提取天麻總酚成分的方法。