hiPSC-ACM和hiPSC-VCM進行藥物毒性檢測的效果研究

孫瑩

（廣東司法警官職業(yè)學院司法鑒定中心，廣東 廣州 510520）

0 引言

當前藥物的毒性評價主要包括動物模型、動物原代心肌細胞等，通量較低，在實際應用中存在種屬差異，影響毒性評價結果[1]。人源性誘導多能干細胞分化心房肌細胞（hiPSC-ACM）和心室肌細胞（hiPSC-VCM）與人體心肌細胞特征相同，避免了種屬差異問題，能夠無限增殖，縮短藥物研發(fā)成本和時間，為藥物毒性高通量篩查提供了重要的參考依據[2]。為了探討體外評價心臟藥物毒性的有效方法，本文就hiPSC-ACM和hiPSCVCM進行藥物毒性檢測的效果進行了探索。

1 資料與方法

1.1 一般資料。中科院上海細胞生物學研究所提供的hiPSC細胞系；美國Sigma公司提供的全反式視黃酸（RA）、RA通路抑制劑、鼠抗輔肌動蛋白（α-acti nin）；BIOBASE酶標儀；賽默飛Attune NxT流式細胞儀；BiO-Rad公司提供的無血清培養(yǎng)基、PBS溶液；翌圣生物科技（上海）有限公司提供的鈣敏染料；美國Abcam公司提供的兔心室特異性標志物（MLC2v）抗體；BIO-RAD TC20自動細胞計數器。

1.2 方法。通過培養(yǎng)hiPCS細胞，用RA處理作為RA組，用RA抑制劑處理作為RAi組。待細胞分化到12～16 d時更換成純化液，如可見成纖維細胞脫落則提可終止純化過程，改為2%心肌培養(yǎng)基，隔日換液。使用細胞免疫熒光染色法、流式細胞法測定α-actinin、cTnT、MLC2v，使用Trizol法完成細胞RNA提取操作，逆轉錄為cDNA，使用實時熒光定量PCR測定MLC2v、MYH7、NR2F2、KCNA5表達。采用細胞活性實驗、鈣離子熒光探針檢測細不同濃度特非那定、索他洛爾培養(yǎng)24 h后的hiPSCACM、VCM細胞活性和鈣瞬變。

1.3 觀察指標。比較兩組細胞的心肌細胞純度；比較兩組心室肌細胞、心房肌細胞特異性標志物相對表達量；分析特非那定、索他洛爾在不同濃度下對hiPSC-ACM、VCM細胞活性和細胞鈣瞬變的影響。

1.4 統(tǒng)計學分析。將數據錄至SPSS 23.0，以χ2檢驗定性資料（%、n），以t檢驗定量資料（±s），P＜0.05，提示有差異。

2 結果

2.1 兩組細胞的心肌細胞純度比較。RA組cTnT陽性率為99.00%，RAi組為98.84%，兩組細胞的心肌細胞純度＞95%。兩組細胞經免疫熒光雙染MLC2v、α-actinin處理后，可見兩組細胞均呈α-actinin表達，其中RA組M LC2v陽性率為6.42%，RAi組為94.56%，后者MLC2v表達陽性率高于前者。RA組分化的細胞90%以上為hiPSCACM，RAi組分化的細胞90%以上為hiPSC-VCM。

2.2 兩組心室肌細胞、心房肌細胞特異性標志物相對表達量對比。RA組MLC2v、MYH7相對表達量低于RAi組，RA組NR2F2、KCNA5相對表達量高于RAi組，詳見表1。

表1 兩組心室肌細胞、心房肌細胞特異性標志物相對表達量對比（±s）

表1 兩組心室肌細胞、心房肌細胞特異性標志物相對表達量對比（±s）

注：★P＜0.05。

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2.3 特非那定在不同濃度下對hiPSC-ACM、VCM細胞活性和細胞鈣瞬變的影響。藥物濃度為100.00 μmol/L時，兩種細胞活性明顯降低。兩種細胞的鈣瞬變振幅在低濃度50 nmol/L時明顯降低，見表2。

表2 特非那定在不同濃度下對hiPSC-ACM、VCM細胞活性和細胞鈣瞬變的影響（±s）

表2 特非那定在不同濃度下對hiPSC-ACM、VCM細胞活性和細胞鈣瞬變的影響（±s）

注：培養(yǎng)24 h后進行比較；★P＜0.05。

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2.4 索他洛爾在不同濃度下對hiPSC-ACM、VCM細胞活性和細胞鈣瞬變的影響。濃度為1.00 μmol/L時兩種細胞活性明顯降低，低濃度1 μmol/L時ACM細胞鈣瞬變振幅明顯降低，VCM細胞的鈣瞬變振幅隨著藥物濃度的增長并未發(fā)生明顯變化，見表3。

表3 索他洛爾在不同濃度下對hiPSC-ACM、VCM細胞活性和細胞鈣瞬變的影響（±s）

表3 索他洛爾在不同濃度下對hiPSC-ACM、VCM細胞活性和細胞鈣瞬變的影響（±s）

注：培養(yǎng)24 h后進行比較；★P＜0.05。

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3 討論

RA信號途徑在心臟祖細胞發(fā)育、分化過程中具有重要的作用。相關報道顯示，RA在早期發(fā)育期間能夠促進肝細胞向心房肌樣細胞方向分化，在體外誘導分化中得到了廣泛應用[3]。本次研究結果顯示，RA組cTnT陽性率為99.00%，RAi組cTnT陽性率為98.84%，說明兩組心肌細胞純度較高，其中RAi組MLC2v陽性率高于RA組，且RA組分化的細胞90%以上為hiPSC-ACM，RAi組分化的細胞90%以上為心室肌細胞（hiPSC-VCM），說明RA在心肌分化過程中可調控心肌亞群向心室或心房方向分化，作用有效率較高。且RA組MLC2v、MYH7相對表達量低于RAi組，RA組NR2F2、KCNA5相對表達量高于RAi組，提示RAi可促進hiPSCs向VCM分化，RA可促進hiPSCs向ACM分化[4]。

抗組胺藥物特非那定、非選擇性β受體抑制劑均為致心律失常藥物，對人體心臟具有一定的毒性。本文中特非那定濃度為100 μmol/L時hiPSC-ACM、hiPSCVCM兩種細胞活性明顯降低，可見特非他定對心肌毒性較大，用藥安全窗較窄，在低濃度50 nmol/L時兩種細胞的鈣瞬變振幅明顯降低，且hiPSC-VCM細胞的鈣瞬變振幅會隨著藥物濃度的增長而逐步下降。索他洛爾濃度為1.00 μmol/L時兩種細胞活性顯著下降，且隨著濃度的升高細胞活性會隨之降低，但細胞活性降幅較小，提示索他洛爾對心肌細胞的毒性較小，安全窗較寬，在低濃度1 μmol/L時hiPSC-ACM細胞的鈣瞬變振幅明顯降低，而hiPSC-VCM細胞的鈣瞬變振幅隨著藥物濃度的增長并未發(fā)生明顯變化，表明索他洛爾對心房肌細胞鈣活動的影響更加明顯[5-6]。

綜上所述，hiPSC-ACM、hiPSC-VCM可能通過調控RA通道分化的心室、心房肌細胞建立體外毒性評價模型，通過檢測兩種細胞的鈣瞬變、細胞活性可為醫(yī)師評價藥物毒性提供重要的參考依據。