多汁乳菇多糖的分離純化及三種食用菌多糖的抗氧化研究

丁慧敏,朱亞男,王秋艷,黃馨閱,陶明煊

(南京師范大學(xué)食品與制藥工程學(xué)院,江蘇 南京 210023)

人體內(nèi)的自由基主要包括羥基自由基、氫過氧化物、超氧陰離子等活性氧自由基[1],這些自由基的氧化性極強(qiáng),一旦過量就會(huì)攻擊核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子,發(fā)生超氧化反應(yīng),破壞人體正常生長發(fā)育,加快衰老速度,誘發(fā)各種疾病.

多糖是一類由糖苷鍵連接而成的生物大分子,是食用菌中的主要活性物質(zhì),在保健品和醫(yī)療上有著廣泛應(yīng)用[2-4]. 目前,國內(nèi)外已有許多研究證實(shí)了食用菌多糖具有抗氧化、抑制腫瘤、提高免疫等性能,在一些疾病的預(yù)防與治療上表現(xiàn)出積極的效果[5-6].

多汁乳菇(LactariusvolemusFr.)又稱奶漿菌、奶汁菇等[7],屬傘菌目、紅菇科、乳菇屬,富含人體所需的氨基酸如賴氨酸、蘇氨酸等,是一種營養(yǎng)保健性能兼佳的食用真菌.

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

材料:多汁乳菇采購于麼麼特產(chǎn)店;白玉菇多糖(RPHM)、姬菇多糖(RPPC)由實(shí)驗(yàn)室前期制得.

試劑:水楊酸、無水乙醇、鄰苯三酚、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、FeSO4、鐵氰化鉀、維生素C均為國產(chǎn)分析純,購買于上海凌峰化學(xué)試劑有限公司.

儀器:MCFD5005冷凍真空干燥機(jī),上海優(yōu)浦科學(xué)儀器有限公司;754紫外可見分光光度計(jì),上海光譜儀器有限公司;GL-22M高速冷凍離心機(jī),上海趙迪生物科技有限公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 多汁乳菇子實(shí)體多糖的提取

將多汁乳菇子實(shí)體粉碎過篩,保存于干燥器中. 準(zhǔn)確稱取干粉25 g,按料液比1∶20加入蒸餾水超聲破碎后進(jìn)行熱水浸提,6 000 g離心15 min,合并上清液,濃縮至一定體積后加入其體積4倍量的95%乙醇進(jìn)行醇沉,于4 ℃靜置12 h后,離心取沉淀,60 ℃恒溫烘干得多汁乳菇粗多糖(CPLV)[8-9].

1.2.2 多汁乳菇子實(shí)體多糖的純化

根據(jù)文獻(xiàn)[10]中除蛋白方法略作修改,取10%多汁乳菇粗多糖溶液,按體積比5∶1加入Sevage(氯仿∶正丁醇=4∶1)試劑,搖床振蕩30 min,6 000 g離心15 min,取上層多糖溶液重復(fù)多次直至無明顯蛋白層,旋蒸除去有機(jī)試劑,透析濃縮凍干,得多汁乳菇多糖(RPLV).

1.2.3 RPLV、RPHM、RPPC化學(xué)組分的測(cè)定

(1)總糖含量的測(cè)定

采用苯酚-硫酸顯色法[11],分別移取0.05 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL于試管中,補(bǔ)加蒸餾水至1.0 mL,加入5%苯酚溶液0.5 mL,再加入2.5 mL濃硫酸,靜置30 min,取出,以第一管作空白對(duì)照,測(cè)定490 nm處的吸光度.

(2)總酚含量的測(cè)定

采用福林酚試劑還原比色法[12],分別移取0.1 mg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL于25 mL棕色容量瓶中,補(bǔ)加蒸餾水至6 mL,加入0.5 mL福林酚試劑、1 mL飽和Na2CO3溶液,用蒸餾水定容至25 mL,于室溫下避光反應(yīng)30 min,測(cè)定760 nm處的吸光度.

(3)總黃酮含量的測(cè)定

采用NaNO2-Al(NO3)3·9H2O-NaOH比色法[13],分別準(zhǔn)確移取0.1 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL于試管中,補(bǔ)加60%乙醇溶液至5 mL,加入5% NaNO2溶液0.3 mL,混勻后靜置6 min,再加入10%硝酸鋁溶液0.5 mL,靜置6 min,加入1 mol/L NaOH溶液4 mL,混勻后室溫反應(yīng)15 min,以第一管為空白對(duì)照,測(cè)定510 nm處的吸光度.

(4)硫酸基含量測(cè)定

采用氯化鋇-明膠比色法[14],分別移取0.2 mg/mL K2SO4標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于試管中,補(bǔ)加蒸餾水至1 mL,加入0.8%三氯乙酸溶液0.7 mL和0.5% BaCl2-明膠溶液0.5 mL,靜置15 min后測(cè)定360 nm處的吸光度.

(5)糖醛酸含量測(cè)定

采用硫酸-咔唑比色法[15],分別準(zhǔn)確移取0.1 mg/mL葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL于具塞試管中,補(bǔ)加超純水至1 mL,在冰浴條件下加入四硼酸鈉-硫酸溶液5 mL,100 ℃水浴10 min,在冰水浴條件下加入咔唑-乙醇溶液0.2 mL,搖勻后沸水浴15 min,冷卻至室溫后,測(cè)定523 nm處的吸光度.

(6)蛋白質(zhì)含量測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)法[16],分別移取1 mg/mL BSA溶液0、10、20、40、60、80、100 μL于試管中,補(bǔ)加蒸餾水至100 μL,充分混合,加入5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250試劑,混合均勻,靜置20 min后測(cè)定595 nm處的吸光度.

1.2.4 RPLV、RPHM、RPPC體外抗氧化活性測(cè)定

(1)清除羥基自由基(·OH)活性的測(cè)定

H2O2和Fe2+混合會(huì)發(fā)生Fenton反應(yīng)[17],生成·OH. ·OH被水楊酸捕獲生成的有色物質(zhì)在510 nm處有特征吸收峰. 本實(shí)驗(yàn)在水楊酸法[18]的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn),分別移取1 mL不同濃度的多糖溶液,各加入1 mL的9 mmol/L FeSO4、9 mmol/L水楊酸-乙醇、8.8 mmol/L H2O2,于37 ℃反應(yīng)30 min,以蒸餾水作為空白對(duì)照. 多糖的本底吸光度以1 mL蒸餾水代替H2O2進(jìn)行測(cè)定,以相同濃度的維生素C作為陽性對(duì)照,測(cè)量510 nm處的吸光度.

清除率(%)=[A0-(Ax-Ax0)]/A0×100%,

(1)

式中,A0為空白對(duì)照的吸光度;Ax為加入多糖溶液后的吸光度;Ax0為多糖溶液的本底吸光度.

采用鄰苯三酚自氧化法[19],此反應(yīng)在25 ℃水浴下進(jìn)行,分別移取1 mL不同濃度的多糖溶液,加入0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液4 mL,再加入25 mmol/L鄰苯三酚溶液0.5 mL,搖勻,靜置5 min,最后以0.1 mL 8%鹽酸溶液來終止反應(yīng),在325 nm處測(cè)定吸光度. 多糖的本底吸收值用蒸餾水代替鄰苯三酚,空白對(duì)照用蒸餾水代替多糖溶液,陽性對(duì)照用相同濃度的維生素C進(jìn)行測(cè)定.超氧陰離子自由基的清除率按式(1)進(jìn)行計(jì)算.

(3)清除DPPH自由基活性的測(cè)定

DPPH溶于乙醇后呈深紫色,于517 nm出現(xiàn)最強(qiáng)吸收峰[20]. 當(dāng)DPPH被清除時(shí),由于DPPH醇溶液中單電子的含氮自由基被清除自由基的物質(zhì)配對(duì)[12-13],會(huì)出現(xiàn)一個(gè)明顯的顏色特征即溶液顏色變淺. 本文按于海洋[21]的方法稍作修改后進(jìn)行測(cè)定,測(cè)定管中加入2 mL不同濃度的樣品溶液、0.2 mmol/L DPPH溶液,混勻,避光靜置30 min后測(cè)量517 nm處下各濃度的吸光度. 以相同濃度的維生素C作為陽性對(duì)照,以蒸餾水為空白對(duì)照,以多糖溶液與95%乙醇為本底吸光度,DPPH自由基的清除率按式(1)計(jì)算.

(4)還原力的測(cè)定

多糖的抗氧化能力可通過Fe3+被還原的數(shù)量來測(cè)定[22],分別移取2.5 mL不同濃度的樣品溶液、0.2 mol/L pH6.6磷酸緩沖溶液和1%鐵氰化鉀溶液,搖勻,于50 ℃水浴20 min,冷卻至室溫,加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液,離心取上清液2.5 mL,加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1%三氯化鐵溶液,10 min后測(cè)定700 nm處的吸光度. 空白對(duì)照組以蒸餾水進(jìn)行測(cè)定,陽性對(duì)照組以相同濃度的維生素C進(jìn)行測(cè)定.

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

重復(fù)3次實(shí)驗(yàn),利用DPS13.50統(tǒng)計(jì)軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù).

2 結(jié)果與分析

2.1 RPLV的提取得率

多汁乳菇子實(shí)體經(jīng)3次超聲破碎輔助熱水浸提后,獲得多汁乳菇粗多糖(CPLV),得率為6.17%. 多汁乳菇粗多糖經(jīng)Sevage法脫蛋白后得多汁乳菇多糖(RPLV),得率為3.21%.

2.2 RPLV、RPHM、RPPC的化學(xué)組分

RPLV、RPHM、RPPC的化學(xué)組分如表1所示.

表1 RPLV、RPHM、RPPC的化學(xué)組分Table 1 Chemical composition of various polysaccharides from RPLV,RPHM,RPPC

2.3 RPLV、RPHM、RPPC的體外抗氧化活性

2.3.1 清除羥基自由基(·OH)能力

由圖1可知,在0～10 mg/mL之間,RPLV、RPHM、RPPC清除羥基自由基的能力與其質(zhì)量濃度呈現(xiàn)依賴性. 在2 mg/mL以下,RPLV、RPHM、RPPC清除羥基自由基的能力相差不大,都遠(yuǎn)低于維生素C;當(dāng)濃度在 2～10 mg/mL時(shí),RPLV、RPHM、RPPC對(duì)羥基自由基的清除率的差異比較明顯,以RPPC的清除效果更好;當(dāng)濃度為10 mg/mL時(shí),RPLV、RPHM、RPPC對(duì)羥基自由基的清除率分別達(dá)到77.6%、78.9%和86.9%,RPLV與RPHM之間無顯著性關(guān)系(P>0.05),RPLV與RPPC差異極顯著(P<0.01),RPHM與RPPC之間差異顯著(P<0.05). 由此可見,RPLV、RPHM、RPPC 3種多糖均可較好地清除羥基自由基,RPPC的清除效果最佳.

圖1 RPLV、RPHM、RPPC對(duì)羥基自由基的清除率Fig.1 The scavening ability on ·OH of RPLV,RPHM,RPPC

圖2顯示,隨著多糖濃度的增加,RPLV、RPHM、RPPC清除超氧自由基的能力呈一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系,且在這3種多糖中,RPPC的清除效果更好,但不及維生素C. 在濃度為1 mg/mL時(shí),RPLV、RPHM、RPPC對(duì)超氧自由基的清除率分別為51.8%、58.0%和63.0%,RPLV、RPHM、RPPC三者間兩兩差異極顯著(P<0.01). 由此可見,RPLV、RPHM、RPPC均可較好地清除超氧自由基,RPPC的清除效果最佳.

圖2 RPLV、RPHM、RPPC對(duì)超氧陰離子自由基的清除率Fig.2 The scavening ability on of RPLV,RPHM,RPPC

2.3.3 清除DPPH自由基能力

由圖3可知,在0～25 mg/mL范圍內(nèi),隨著樣品的濃度增加,RPLV、RPHM、RPPC對(duì)DPPH自由基的清除能力也隨之增大. 在20～25 mg/mL之間,RPHM、RPLV、RPPC清除率增加趨勢(shì)放緩. 當(dāng)濃度為25 mg/mL時(shí),RPLV、RPHM、RPPC對(duì)DPPH自由基的清除率分別為51.90%、54.30%和70.63%,RPLV與RPHM差異顯著(P<0.05),RPPC與RPLV、RPHM差異極顯著(P<0.01). 由此可見,RPLV、RPHM、RPPC均可較好地清除DPPH自由基,以RPPC的清除效果最佳,但不及維生素C.

圖3 RPLV、RPHM、RPPC對(duì)DPPH自由基的清除率Fig.3 The reducing power on ·DPPH of RPLV,RPHM,RPPC

2.3.4 還原力

由圖4可知,RPLV、RPHM、RPPC的還原力與樣品的質(zhì)量濃度呈一定的依賴性. 在1 mg/mL以下,多糖的還原能力RPLV0.05),與維生素C的還原力(2.7)非常接近. 由此可見,RPLV、RPHM、RPPC均是良好的還原劑,其中RPPC的還原力最佳.

圖4 RPLV、RPHM、RPPC的還原能力Fig.4 The reducing power of of RPLV,RPHM,RPPC

3 結(jié)論

自由基過多可誘發(fā)多種疾病,從而影響人體健康[23]. 清除體內(nèi)過多的自由基除了靠自身?xiàng)l件外,還可通過攝入含有抗氧化劑的營養(yǎng)物質(zhì). 當(dāng)前市場(chǎng)上出現(xiàn)的抗氧化劑基本上是合成藥物,長期攝入可能會(huì)對(duì)人體造成傷害. 有研究表明食用菌多糖具有抗氧化[24]的功效,因此食用菌多糖在天然無毒抗氧化劑方面的應(yīng)用顯得日益重要,已成為當(dāng)下的研究熱點(diǎn).