運(yùn)動(dòng)鍛煉對(duì)更年期抑郁模型大鼠行為學(xué)影響及機(jī)制研究*

呂麗華，陳登榜，曾 俊△，代呂霞△

1.武漢市精神衛(wèi)生中心(武漢 430030)；2.成都醫(yī)學(xué)院(成都 610083)

抑郁癥是一種全球性的慢性神經(jīng)精神障礙。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，目前全世界約有3.5億人患抑郁癥，已成為發(fā)病率居全球第二位的疾病[1]。流行病學(xué)調(diào)查[2]顯示，女性抑郁癥的發(fā)病率大概是男性的2.5倍，尤其在45～55歲的更年期，有近46%女性罹患更年期抑郁癥。處于更年期的婦女，由于雌激素急劇減少，身體和精神出現(xiàn)障礙，情緒變化較大，常出現(xiàn)一些過(guò)激行為，給患者自身和家庭均帶來(lái)一定程度痛苦。

運(yùn)動(dòng)鍛煉是一種能堅(jiān)持、簡(jiǎn)單、有效的緩解機(jī)體壓力的方式。研究[3-4]顯示，運(yùn)動(dòng)鍛煉可增強(qiáng)體質(zhì)、改善情緒，對(duì)身心有積極的效果。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain derived neurothrophic factor，BDNF)是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族的成員，與抑郁發(fā)生密切相關(guān)。本研究探討運(yùn)動(dòng)鍛煉能否改善更年期抑郁模型大鼠的抑郁情緒，以及運(yùn)動(dòng)鍛煉對(duì)更年期抑郁模型大鼠血清和海馬中BDNF表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雌性，SD大鼠40只，體重200～240 g，購(gòu)于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑

BCA蛋白定量試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；BDNF大鼠多克隆抗體(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；羊抗鼠IgG抗體(北京中杉生物技術(shù)有限公司)；預(yù)染蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(美國(guó)New England公司)；ECL化學(xué)發(fā)光試劑(德國(guó)Millipore公司)；Rat BDNF ELISA Kit分析試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物飼養(yǎng) 自由供水、供食，自然光照。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組 將大鼠隨機(jī)分成正常組、假手術(shù)組、去卵巢組、去卵巢+運(yùn)動(dòng)組4組，每組10只。

1.3.3 動(dòng)物模型 1)卵巢摘除。通過(guò)雙側(cè)去卵巢手術(shù)構(gòu)建更年期大鼠動(dòng)物模型，以此模擬女性雌激素缺乏的更年期。大鼠在動(dòng)物房適應(yīng)1周后，術(shù)前禁食12 h，7%水合氯醛(0.5 mL/100 g)腹腔麻醉，麻醉起效后，俯臥位固定，備皮，背部肋弓下1 cm與脊柱側(cè)面1 cm相交處，開(kāi)約2 cm切口，鈍性分離，暴露腹腔，找到粉紅色菜花狀的卵巢。在近子宮角位置進(jìn)行結(jié)扎，切除卵巢，常規(guī)縫合，同樣方法摘除另一卵巢，待大鼠完全清醒后放回籠子。術(shù)后連續(xù)5 d，腹腔注射青霉素(20萬(wàn)單位/只)預(yù)防感染。假手術(shù)組手術(shù)操作與卵巢摘除手術(shù)相同，但不切除卵巢，僅切除雙側(cè)卵巢周?chē)润w積的脂肪。2)慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激(CUMS)造模。術(shù)后2周，進(jìn)行慢性不可預(yù)見(jiàn)應(yīng)激以建構(gòu)更年期抑郁大鼠模型。正常組和假手術(shù)組正常飼養(yǎng)，將摘除卵巢的大鼠進(jìn)行造模，每天隨機(jī)給予1～2種不同刺激，持續(xù)28 d。造模過(guò)程中，同種刺激再次出現(xiàn)的間隔周期>5 d。刺激方法：鼠籠傾斜(將鼠籠傾斜至45°)；持續(xù)光照(通宵照明12 h)；禁食24 h；禁水24 h；氣味刺激(鼠籠內(nèi)放置2個(gè)樟腦球)；旋轉(zhuǎn)刺激(置于旋轉(zhuǎn)架上旋轉(zhuǎn)3 min)；4 ℃冷水中5 min；45 ℃熱水中5 min；束縛(橡皮膏束縛四肢限制活動(dòng)3 h)；無(wú)墊料24 h；潮濕墊料24 h；夾大鼠尾巴根部1 min。3)強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)。大鼠單獨(dú)放入透明玻璃圓缸中(高45 cm，直徑20 cm, 水深以大鼠尾巴剛好探不到底)，水溫(25±1)℃。第1天置于缸內(nèi)5 min，不記錄時(shí)間。第2天5 min, 記錄大鼠保持漂浮不動(dòng)的時(shí)間。強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)在建模結(jié)束后和運(yùn)動(dòng)鍛煉6周后各進(jìn)行1次。建模成功的模型大鼠隨機(jī)分為去卵巢組和去卵巢+運(yùn)動(dòng)組。

1.3.4 運(yùn)動(dòng)鍛煉 去卵巢+運(yùn)動(dòng)組大鼠開(kāi)始為期6周的水平跑臺(tái)鍛煉。運(yùn)動(dòng)時(shí)間45 min，第1周初始速度為10 m/min，每隔5 min速度增加3 m/min，當(dāng)速度達(dá)到20 m/min后，保持20 m/min直至運(yùn)動(dòng)結(jié)束。第2周初始速度為15 m/min，每隔5 min速度增加3 m/min，當(dāng)速度達(dá)到20 m/min后，保持20 m/min直至運(yùn)動(dòng)結(jié)束。第3周至第6周保持20 m/min的速度進(jìn)行運(yùn)動(dòng)[5-6]。每周跑步5 d，周六、周日休息。其余組大鼠未給予跑步干預(yù)。

1.3.5 樣品制備 1)收集血清。大鼠麻醉后，固定，負(fù)壓抗凝管采集大鼠動(dòng)脈血。樣品室溫靜置30 min，2 000 r/min，離心半徑14 cm，離心20 min，收集上清，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?)提取海馬。立即將各組大鼠斷頭處死，取出大腦，冰上放置1個(gè)培養(yǎng)皿，在培養(yǎng)皿中迅速將海馬組織剝離出來(lái)，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?)提取蛋白。腦組織解凍后，加入裂解緩沖液，低溫高速勻漿機(jī)勻漿，運(yùn)行3 min，暫停3 min，重復(fù)3次。4 ℃，12 000 r/min，離心半徑14 cm，離心20 min，提取上清，即為組織的蛋白樣本，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?4)蛋白定量。參照上海碧云天生物技術(shù)有限公司BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。用ROH2O將待測(cè)樣品進(jìn)行稀釋?zhuān)瑢?zhǔn)備好的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品加入96孔板，再加入BCA工作液，充分混勻，37 ℃放置30 min。酶標(biāo)儀測(cè)定各孔OD562。Excel軟件制作蛋白濃度/D值的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，導(dǎo)出回歸方程式。根據(jù)公式，乘以稀釋倍數(shù)，計(jì)算出樣品蛋白的實(shí)際濃度。

1.3.6 ELISA法 參照碧云天生物技術(shù)有限公司Rat BDNF ELISA Kit分析試劑盒使用說(shuō)明書(shū)步驟，檢測(cè)大鼠血清BDNF含量，每個(gè)孔均作3個(gè)復(fù)孔以減少誤差。

1.3.7 蛋白質(zhì)印跡技術(shù) 大鼠海馬BDNF的表達(dá)取蛋白樣品，加入5×SDS上樣緩沖液混勻；100 ℃加熱5 min；10 000 轉(zhuǎn)/min，離心半徑14 cm，離心2 min，取上清。電泳條件：5%濃縮膠區(qū)域80 V恒壓，10%分離膠區(qū)域100 V恒壓，電泳時(shí)間約為120 min。待電泳結(jié)束后，取下SDS-PAGE凝膠，剪裁跟凝膠同樣大小的PVDF膜(甲醇中浸泡10 s)；凝膠和PVDF膜放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡30 min；按轉(zhuǎn)移電極板負(fù)極至正極方向整齊疊放3層濾紙、凝膠、PVDF膜和3層濾紙，4 ℃、200 mA恒流轉(zhuǎn)膜60 min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，取出PVDF膜，4 ℃封閉過(guò)夜；1×PBST洗膜10 min×3次；加入按1∶1 000用封閉液稀釋的一抗(BDNF抗體)，4 ℃孵育過(guò)夜；1×PBST洗膜10 min×3次；加入按1∶2 000用封閉液稀釋的二抗(辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG)，37 ℃搖床孵育60 min；1×PBST洗膜10 min×3次；按Millipore ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作步驟對(duì)膜進(jìn)行顯色，觀(guān)察結(jié)果并拍照存檔。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)變化

建模結(jié)束后，通過(guò)強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)，收集大鼠漂浮不動(dòng)的時(shí)間，以明確建模是否成功。結(jié)果顯示，模型組、正常組、假手術(shù)組大鼠的不動(dòng)時(shí)間分別為(153.9±1.1)、(110.2±1.8)、(113.0±1.6)s。與正常組相比，假手術(shù)組大鼠的不動(dòng)時(shí)間無(wú)明顯增加，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與正常組相比，模型組大鼠的不動(dòng)時(shí)間明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示更年期抑郁大鼠模型建模成功(表1)。

表1 建模結(jié)束后強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)總評(píng)分結(jié)果

運(yùn)動(dòng)鍛煉6周后，再次進(jìn)行強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，去卵巢+運(yùn)動(dòng)組、去卵巢組、正常組及假手術(shù)組大鼠的不動(dòng)時(shí)間分別為(124.8±1.3)、(155.8±1.8)、(118.4±1.5)、(121.6±2.0) s。與正常組相比，去卵巢組大鼠的不動(dòng)時(shí)間明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與去卵巢組相比，去卵巢+運(yùn)動(dòng)組大鼠的不動(dòng)時(shí)間明顯縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，中等強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)鍛煉能有效改善更年期抑郁大鼠的情緒狀態(tài)(表2)。

表2 運(yùn)動(dòng)鍛煉6周后強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)總評(píng)分結(jié)果

2.2 大鼠血清BDNF含量

運(yùn)動(dòng)鍛煉6周后，ELISA檢測(cè)外周血中BDNF含量結(jié)果顯示，去卵巢+運(yùn)動(dòng)組、去卵巢組、正常組、假手術(shù)組BDNF含量分別為(196.5±6.5)、(132.1±2.4)、(216.7±7.6)、(199.5±6.6) μg/L。與正常組相比，去卵巢組BDNF含量明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與去卵巢組相比，去卵巢+運(yùn)動(dòng)組BDNF含量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。ELISA結(jié)果證實(shí)中等強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)鍛煉能明顯增加更年期抑郁大鼠外周血BDNF的含量(表3)。

表3 運(yùn)動(dòng)鍛煉6周后血清BDNF含量

2.3 大鼠海馬BDNF的表達(dá)量

運(yùn)動(dòng)鍛煉6周后，蛋白質(zhì)印跡技術(shù)進(jìn)一步檢測(cè)各組大鼠海馬BDNF的表達(dá)量，并使用Image Lab軟件分析條帶灰度值，本研究將目標(biāo)蛋白與內(nèi)參條帶灰度值的比值作為目標(biāo)蛋白相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，去卵巢+運(yùn)動(dòng)組、去卵巢組、正常組、假手術(shù)組BDNF相對(duì)表達(dá)量為(0.520±0.010)、(0.358±0.011)、(0.616±0.015)、(0.588±0.006)。與正常組相比，去卵巢組BDNF相對(duì)表達(dá)量明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與去卵巢組相比，去卵巢+運(yùn)動(dòng)組BDNF相對(duì)表達(dá)量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。蛋白質(zhì)印跡技術(shù)結(jié)果證明，中等強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)鍛煉能明顯增加更年期抑郁大鼠海馬BDNF的表達(dá)(圖1、表4)。

圖1 蛋白質(zhì)印跡技術(shù)檢測(cè)海馬BDNF的表達(dá)

表4 運(yùn)動(dòng)鍛煉6周后海馬BDNF相對(duì)的表達(dá)量

3 討論

隨著社會(huì)的進(jìn)步，人們工作、生活壓力劇增，我國(guó)女性抑郁癥的發(fā)生率也不斷增加，其中更年期女性尤為突出。更年期由于激素水平變化，女性易出現(xiàn)心血管、內(nèi)分泌等身體機(jī)能的疾患，還可出現(xiàn)抑郁焦慮等心理問(wèn)題，嚴(yán)重影響女性的健康與生活。高兵等[7]調(diào)查了110名圍絕經(jīng)期婦女，結(jié)果顯示，出現(xiàn)抑郁癥狀的婦女約35.5%，其中具有輕度抑郁癥狀的婦女約76.9%；抑郁癥狀與更年期綜合征癥狀具有明顯的相關(guān)性。黃銀娟[8]調(diào)査發(fā)現(xiàn)，家庭、生活環(huán)境、社交關(guān)系、自我調(diào)節(jié)能力及運(yùn)動(dòng)、既往疾病史等因素對(duì)更年期抑郁焦慮狀況的發(fā)生均有影響作用。本研究通過(guò)卵巢切除和慢性不可預(yù)知性應(yīng)激兩步法來(lái)建造更年期抑郁大鼠模型，利用強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)篩選具有明顯抑郁癥表現(xiàn)的大鼠，以避免去卵巢組和去卵巢+運(yùn)動(dòng)組里出現(xiàn)輕度抑郁或正常大鼠，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更具有可信度[9]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組大鼠的不動(dòng)時(shí)間明顯增加，這與既往研究[9]具有一致性。

藥物和電休克等是目前臨床常用的抑郁癥治療方式，但由于不良反應(yīng)大，導(dǎo)致患者依從性差，促使研究者們努力尋找更有效的治療方式。研究[10]認(rèn)為，運(yùn)動(dòng)鍛煉作為一種簡(jiǎn)單有效、不良反應(yīng)極少的治療方式，可有效緩解抑郁癥患者的癥狀，改善患者的情緒狀態(tài)。Dunn等[11]認(rèn)為，在抑郁癥的治療中，運(yùn)動(dòng)鍛煉的類(lèi)型、持續(xù)時(shí)間及運(yùn)動(dòng)頻率等因素會(huì)產(chǎn)生不同的效果。長(zhǎng)時(shí)間、高強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)鍛煉由于過(guò)度激活HPA軸而使患者身心緊張，導(dǎo)致抑郁癥狀加重[12]；而中等強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)鍛煉則是減少應(yīng)激的最有效方法[13]。因此本實(shí)驗(yàn)采用中等強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)，運(yùn)動(dòng)鍛煉的參數(shù)在相關(guān)文獻(xiàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行了細(xì)微的調(diào)整[14]，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)中等強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)鍛煉的確可以明顯改善更年期抑郁模型大鼠的情緒癥狀。

BDNF在神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育和神經(jīng)元的修復(fù)方面具有十分重要的作用，BDNF在海馬、杏仁核及額葉皮層等部位表達(dá)量較高。研究[15]發(fā)現(xiàn)，BDNF與抑郁癥的發(fā)生密切相關(guān)，應(yīng)激可引起腦邊緣系統(tǒng)(如海馬、前額葉皮質(zhì))BDNF蛋白表達(dá)明顯下降，以及相關(guān)的邊緣系統(tǒng)結(jié)構(gòu)萎縮。研究[16]發(fā)現(xiàn)，抑郁癥患者外周單核細(xì)胞BDNF mRNA的含量明顯低于正常人，且BDNF mRNA含量的下降幅度與抑郁的程度呈正比。因此外周血和中樞BDNF含量若發(fā)生一致改變，能較好揭示BDNF在抑郁癥發(fā)病中的作用。結(jié)合更年期抑郁大鼠模型，本實(shí)驗(yàn)探討了外周血BDNF含量和海馬BDNF表達(dá)與更年期抑郁癥的關(guān)系，結(jié)果表明，更年期抑郁模型大鼠外周血BDNF含量和海馬BDNF的表達(dá)是同步下降；經(jīng)過(guò)6周運(yùn)動(dòng)鍛煉后，去卵巢+運(yùn)動(dòng)組外周血BDNF含量和海馬BDNF的表達(dá)量較去卵巢組明顯升高。但本研究也發(fā)現(xiàn)，雖然6周運(yùn)動(dòng)鍛煉能明顯增加更年期抑郁模型大鼠外周血BDNF含量及中樞BDNF的表達(dá)，有效改善大鼠的抑郁狀態(tài)，但并未使大鼠完全恢復(fù)正常狀態(tài)，分析其原因可能是運(yùn)動(dòng)鍛煉的持續(xù)周期還未找到最理想的值，在下一步實(shí)驗(yàn)中，我們將繼續(xù)探究運(yùn)動(dòng)鍛煉8、12周及更長(zhǎng)的時(shí)間對(duì)更年期抑郁模型大鼠行為學(xué)及機(jī)制的影響。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，更年期抑郁模型大鼠經(jīng)過(guò)6周中等強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)鍛煉后，情緒狀態(tài)得到明顯有效的改善；外周血BDNF含量和海馬BDNF表達(dá)量升高，為更年期抑郁治療提供了新的思路。