硫辛酸注射液熱原反應(yīng)因素實(shí)驗(yàn)研究

田恩圣，潘春芬，田雨陽(yáng)，戴曉莉，張君茹

(1.山東省食品藥品審評(píng)查驗(yàn)中心，山東 濟(jì)南 250014；2.淄博市市級(jí)機(jī)關(guān)醫(yī)院，山東 淄博 255000；3.湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢430000；4.山東省藥學(xué)科學(xué)院，山東 濟(jì)南 250100)

熱原反應(yīng)是注射劑經(jīng)常出現(xiàn)的不良反應(yīng)，危害極大，可引起人體發(fā)熱、惡心、嘔吐等反應(yīng)，嚴(yán)重者也導(dǎo)致休克甚至死亡[1]。藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中用鱟試劑或者兔法進(jìn)行檢驗(yàn)。本文對(duì)有疑似熱原反應(yīng)較多的硫辛酸注射液，通過(guò)設(shè)計(jì)毒理試驗(yàn)，研究引發(fā)熱原反應(yīng)的因素，為生產(chǎn)該品種的企業(yè)提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 WRY-C熱原測(cè)溫儀(上海黃海藥檢儀器有限公司)；SC-3012低速離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)； SSW-600-2S型電熱恒溫水浴鍋(上海博迅)；754N紫外分光光度計(jì)(上海精科分析儀器廠)；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)UV7(梅特勒-托利多國(guó)際有限公司)；TAL-40D型試管恒溫儀(湛江安度斯生物有限公司)。

1.2 藥品與試劑 鱟試劑(批號(hào):1708230，湛江博康生物有限公司)；內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào):150601-201783，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；硫辛酸實(shí)驗(yàn)樣品(國(guó)內(nèi)某企業(yè))；硫辛酸注射液對(duì)照樣品(國(guó)內(nèi)某企業(yè))；游離血紅蛋白檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：171205，北京百奧萊博科技有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及環(huán)境 新西蘭兔16只，普通級(jí)，2.2～2.5 kg，由濟(jì)南西嶺角養(yǎng)殖繁育中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(魯)20150001。飼養(yǎng)溫度20～25 ℃，日溫差≤5 ℃，濕度40%～70%，晝夜明暗交替時(shí)間12 h/12 h。

2 方法

2.1 熱原試驗(yàn)[2]參考《中國(guó)藥典》2020年版(四部)中的熱原檢查法進(jìn)行。取篩選合格的新西蘭兔6只，分為硫辛酸注射液實(shí)驗(yàn)組和硫辛酸注射液對(duì)照品組。測(cè)定其正常體溫后15 min以內(nèi)，自耳靜脈緩緩注入溫?zé)嶂良s38 ℃的硫辛酸注射液30 mg·kg-1，給藥體積為1 mL·kg-1。然后每隔30 min按測(cè)量其體溫1次，共測(cè)6次，以6次體溫中最高的一次減去正常體溫，即為該兔體溫的升高溫度(℃)。如3只試驗(yàn)兔中有1只體溫升高0.6 ℃或高于0.6 ℃，或3只試驗(yàn)兔體溫升高的總和達(dá)1.3 ℃或高于1.3 ℃，應(yīng)另取5只試驗(yàn)兔復(fù)試，檢查方法同上。

2.2 內(nèi)毒素檢查[2-3]內(nèi)毒素限值：≤0.25 EU·mg-1(實(shí)驗(yàn)用樣品)，≤0.4 EU·mg-1(國(guó)內(nèi)某企業(yè)對(duì)照樣品)，采用《中國(guó)藥典》2015年版細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法檢驗(yàn)，先計(jì)算最大稀釋倍數(shù)MVD(MVD=CL/λ)，將供試品按照最大稀釋倍數(shù)稀釋制成2支供試品管和2支供試品陽(yáng)性對(duì)照(用該濃度的供試品稀釋液將內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品制成2λ濃度)，另取2支加入細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水作為陰性對(duì)照，2支加入2λ濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液作為陽(yáng)性對(duì)照，將各管按照標(biāo)準(zhǔn)要求，保溫(60±2)min后，觀察并記錄結(jié)果。

2.3 體外溶血試驗(yàn)[4-5]采用2%新西蘭兔紅細(xì)胞懸液為實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，硫辛酸注射液配制成30 mg·mL-1溶液，0.9%氯化鈉注射液為陰性對(duì)照，注射用水為陽(yáng)性對(duì)照。2%紅細(xì)胞懸液的制備，供試液、紅細(xì)胞懸液、生理鹽水的加入方法均按2015年版藥典方法進(jìn)行，計(jì)算溶血率：用分光光度計(jì)法用0.9%氯化鈉注射液調(diào)零后，于545 nm波長(zhǎng)處測(cè)定供試品及對(duì)照品各管上清液吸收度，A為供試品各管上清液吸收度，B為0.9%氯化鈉注射液對(duì)照管上清液吸收度，C為滅菌注射用水管上清液吸收度。

溶血率(%)=(A-B)/(C-B)×100%

2.4 體內(nèi)溶血試驗(yàn)[6]采用新西蘭兔6只進(jìn)行試驗(yàn)，靜脈注射給藥，劑量為30 mg·kg-1，給藥濃度30 mg·mL-1，給藥容積為1 mL·kg-1，給藥1次。藥前、藥后2 h分別兔耳中動(dòng)脈采血約2 mL，置于含有EDTAK2的抗凝管中，離心后分離血漿，測(cè)定血漿中游離血紅蛋白(FHB)含量。

3 結(jié)果

3.1 熱原檢查結(jié)果 結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組硫辛酸注射液在30 mg·kg-1劑量下，第一次試驗(yàn)的3只兔體溫升高均超過(guò)0.6 ℃，復(fù)檢的5只兔體溫升高亦均超過(guò)0.6 ℃，判斷熱原反應(yīng)為陽(yáng)性，而硫辛酸注射液對(duì)照組3只新西蘭兔體溫升高值均小于0.6 ℃，熱原反應(yīng)為陰性，結(jié)果見(jiàn)表1～2。

表1 硫辛酸注射液第一次熱原檢查結(jié)果

表2 硫辛酸注射液第二次熱原檢查結(jié)果

3.2 細(xì)菌內(nèi)毒素結(jié)果 結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組硫辛酸注射液和對(duì)照品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果均為陰性，內(nèi)毒素含量符合要求，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 硫辛酸注射液內(nèi)毒素檢查結(jié)果

3.3 體外溶血試驗(yàn)結(jié)果 結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組硫辛酸注射液在30 mg·mL-1濃度下，加樣0.3 mL后溶血率大于5%，有明顯的溶血反應(yīng)發(fā)生，結(jié)果為陽(yáng)性，而對(duì)照硫辛酸注射液溶血率小于5%，結(jié)果為陰性。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 硫辛酸注射液體外溶血試驗(yàn)結(jié)果

3.4 體內(nèi)溶血試驗(yàn)結(jié)果 給藥前比較，給藥后實(shí)驗(yàn)組硫辛酸注射液組兔血漿中游離血紅蛋白含量顯著升高(P<0.01)，而硫辛酸對(duì)照組兔血漿中游離血紅蛋白含量變化不明顯(P>0.05)。說(shuō)明實(shí)驗(yàn)組硫辛酸注射液可引起新西蘭兔體內(nèi)溶血作用，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 硫辛酸注射液體內(nèi)溶血試驗(yàn)結(jié)果

4 討論

臨床上熱原反應(yīng)較為常見(jiàn)，引發(fā)人體產(chǎn)生熱原反應(yīng)的物質(zhì)為致熱源，也就是導(dǎo)致機(jī)體發(fā)熱的源頭物質(zhì)。致熱源包括外源性致熱源和內(nèi)源性致熱源兩大類。外源性致熱源(exogenous pyrogen)種類甚多，而注射中最主要的致熱源為細(xì)菌內(nèi)毒素[7-8]。藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中熱原檢查通過(guò)鱟試劑法或兔法很容易即可判斷。本實(shí)驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)組硫辛酸注射液進(jìn)行了兔法檢查熱原反應(yīng)，結(jié)果為陽(yáng)性，而鱟試劑法檢查熱原反應(yīng)，結(jié)果為陰性，故分析熱原反應(yīng)并非內(nèi)毒素引起，而有其他致熱源引起。為了進(jìn)一步探討引起熱原反應(yīng)的原因，進(jìn)一步開(kāi)展了溶血試驗(yàn)。

體外溶血試驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組硫辛酸注射液在30 mg·mL-1濃度下，會(huì)引起兔紅細(xì)胞溶血反應(yīng)，為了進(jìn)一步驗(yàn)證體內(nèi)是否溶血，本文采用了新西蘭兔給予30 mg·kg-1劑量開(kāi)展了體內(nèi)溶血試驗(yàn)，通過(guò)檢測(cè)血漿中游離血紅蛋白含量反應(yīng)是否存在溶血[9]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，給藥后2 h，血漿中游離血紅蛋白含量較給藥前顯著升高，說(shuō)明存在明顯的溶血反應(yīng)。結(jié)合體內(nèi)外溶血和熱原反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果，分析實(shí)驗(yàn)組硫辛酸注射液熱原反應(yīng)陽(yáng)性的可能原因?yàn)樗幤繁旧硪l(fā)紅細(xì)胞破裂，導(dǎo)致嚴(yán)重溶血，同時(shí)對(duì)其他細(xì)胞也可能存在破壞作用，釋放激素和(或)細(xì)胞因子等內(nèi)熱原，導(dǎo)致機(jī)體體溫升高[9]。通過(guò)本研究可提示藥品出現(xiàn)熱原反應(yīng)陽(yáng)性時(shí)，未必是細(xì)菌內(nèi)毒素超標(biāo)，也可能是溶血等其他因素所致，應(yīng)多方面查找原因，以便于發(fā)現(xiàn)問(wèn)題，解決問(wèn)題，保障臨床用藥安全。