• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    急性應(yīng)激障礙向創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙發(fā)展小鼠模型的制備

    2021-10-19 08:24:52王子元周文霞
    關(guān)鍵詞:電擊特征分析急性期

    王子元,王 昊,黃 晏,周文霞

    (1.南京中醫(yī)藥大學(xué),江蘇 南京 210023;2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所,抗毒藥物與毒理學(xué)國家重點實驗室,北京 100850)

    應(yīng)激障礙主要有急性應(yīng)激障礙(acute stress disorder,ASD)和創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(post-traumatic disorder,PTSD)[1]。二者的臨床表現(xiàn)相似,均是嚴(yán)重的焦慮反應(yīng)和對創(chuàng)傷線索的重度恐懼[2-3];二者的主要區(qū)別在于癥狀持續(xù)時間,1個月內(nèi)為ASD,超過1個月則為PTSD。早在17世紀(jì),英國就有對PTSD癥狀的記載[4],但直到越南戰(zhàn)爭后才引起人們的重視,并在由美國精神病學(xué)協(xié)會出版的《精神障礙診斷與統(tǒng)計手冊》第Ⅲ版(Diagnostic and Statistical Manual for Mental Disorder,DSM-Ⅲ)中正式收錄PTSD[5]。為了描述應(yīng)激后短時間內(nèi)部分人群出現(xiàn)的應(yīng)激反應(yīng),并且確定急性創(chuàng)傷暴露患者中易發(fā)展為PTSD的高危人群[6],DSM-Ⅳ第一次引入ASD的概念。在最新的DSM-Ⅴ中,進(jìn)一步明確了PTSD和ASD的診斷要點并細(xì)化了診斷依據(jù)。

    有多項研究表明,ASD對PTSD具有中等強度的預(yù)測效度,即超過半數(shù)的ASD患者最終會發(fā)展并被確診為PTSD[7-12]。不過目前對于ASD發(fā)展為PTSD機(jī)制的了解并不透徹,臨床中也缺乏有效的防治藥物,僅有少部分研究顯示,創(chuàng)傷暴露人群在應(yīng)激后6 h內(nèi)給予氫化可的松可以減輕ASD和PTSD的核心癥狀[13]。目前藥物研究多采用單一的條件恐懼模型代表應(yīng)激障礙模型[14-15],這并不符合應(yīng)激障礙的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)。因此,需要基于多個行為學(xué)指標(biāo)進(jìn)行綜合判定。現(xiàn)階段多數(shù)應(yīng)激障礙動物模型僅重點關(guān)注動物在PTSD階段的生理狀態(tài)變化[16-17],建立一個采用多個行為學(xué)實驗綜合評價,觀察從ASD向PTSD發(fā)展過程中生理狀態(tài)變化的動物模型至關(guān)重要。

    創(chuàng)傷經(jīng)歷是應(yīng)激障礙發(fā)生的必要條件,在動物模型中,采用電擊刺激模擬創(chuàng)傷經(jīng)歷具有易于精確調(diào)節(jié)應(yīng)激強度和時程的優(yōu)勢。本研究通過小鼠連續(xù)3 d行足底電擊模擬創(chuàng)傷經(jīng)歷,根據(jù)臨床診斷依據(jù),通過曠場實驗、情景恐懼實驗以及創(chuàng)傷線索回避實驗?zāi)MASD和PTSD的焦慮樣行為、再體驗行為和主動回避行為?;贏SD和PTSD的診斷標(biāo)準(zhǔn),以應(yīng)激后前3 d模擬ASD,以應(yīng)激后第28天模擬PTSD,觀察小鼠行為學(xué)表現(xiàn),通過行為特征分析篩選出不同時期的ASD或PTSD個體,以及不同階段模型組小鼠的ASD和PTSD發(fā)生率,以期為ASD向PTSD的發(fā)展機(jī)制和防治藥物研究提供可靠的動物模型。

    1 材料與方法

    1.1 動物和儀器

    51只雄性SPF級C57BL/6J小鼠,體重20~24 g(北京斯貝福生物技術(shù)有限公司),動物許可證號:SCXK(京)2016-0002。飼養(yǎng)于軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院實驗動物中心,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于實驗。小鼠自由攝食飲水,每日光照/黑暗各12 h。動物實驗室環(huán)境溫度24~26℃,相對濕度40%~60%。動物飼養(yǎng)和所有實驗方案均嚴(yán)格遵守軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院實驗動物倫理委員會的相關(guān)規(guī)定。

    Anymaze動物視頻分析系統(tǒng),美國Stoelting公司;小鼠自主活動性實驗裝置(30 cm×30 cm×30 cm)上海吉量軟件科技有限公司;Supermaze動物視頻分析系統(tǒng),小鼠曠場裝置(40 cm×40 cm×40 cm)和電擊箱(52 cm×30 cm×55 cm),上海欣軟信息科技有限公司。

    1.2 實驗分組

    剔除自主活動過高和過低的小鼠,具體方法為:實驗前將動物置于實驗房間,適應(yīng)環(huán)境30~60 min;實驗期間保持安靜;采用Anymaze軟件及視頻采集系統(tǒng)記錄每只小鼠在自主活動箱中20 min內(nèi)自發(fā)活動總距離;每只小鼠實驗完畢后,用50%乙醇擦拭箱體,避免氣味干擾。以20 min內(nèi)每只小鼠的活動總距離作為其自主活動性的指標(biāo),按照±s(95%置信區(qū)間)的標(biāo)準(zhǔn),將運動距離超過此范圍的小鼠剔除,然后按照體重和自主性活動半隨機(jī)化分為正常對照組和模型組,每組25~26只。對每只小鼠進(jìn)行編號。

    1.3 足底電擊制備應(yīng)激模型

    開始足底電擊的第3天為時間軸的0天(圖1)。小鼠結(jié)束適應(yīng)性飼養(yǎng)后第1天(圖1,-3 d)進(jìn)行自主活動性實驗,依據(jù)實驗數(shù)據(jù)篩選小鼠后,將小鼠隨機(jī)分為正常對照組和模型組。完成分組后第1天(圖1,-2 d)對實驗小鼠進(jìn)行足底電擊。足底電擊強度依據(jù)文獻(xiàn)進(jìn)行微調(diào)[18]。實驗前將動物置于實驗房間,適應(yīng)環(huán)境30 min到1 h;實驗期間保持安靜。電擊箱中放入純黑色物體A,作為創(chuàng)傷事件相關(guān)的線索。小鼠放入電擊箱后適應(yīng)5 min,之后給予模型組小鼠足底電擊,強度為電流0.8 mA,每次持續(xù)10 s,間隔10 s,重復(fù)15次,連續(xù)電擊3 d;正常對照組小鼠放入電擊箱同等時間但不施加電擊。應(yīng)激后仍然保持一籠5~6只小鼠飼養(yǎng)。足底電擊后第1~3天為急性期,依次進(jìn)行曠場實驗、創(chuàng)傷線索回避實驗和情景恐懼實驗。足底電擊后第28~30天為慢性期,實驗進(jìn)行順序同急性期。電擊流程見圖1。

    Fig.1 Schedule of behavioral experiment.Mice were placed in the experimental room before the experiment and acclimated to the environment for 30 min to 1 h.A solid black object A was placed in the shock box as a cue related to the traumatic event.The mice were placed in the shock box and acclimatized for 5 min,after which the model mice were given foot shocks with a current of 0.8 mA,each lasting 10 s,at 10 s intervals,and repeated 15 times for 3 d(-2 d-0 d).The normal control mice were placed in the shock box for the same amount of time but no electric shocks were applied.OFT:open field test;TCAT:traumatic cue avoidance test;CF:contextual fear test.

    1.4 曠場實驗檢測焦慮樣行為相關(guān)指標(biāo)

    在完成足底電擊后的第1天和第28天進(jìn)行實驗,分別檢測活動總距離(overall distance),中心區(qū)域運動時間(time in center),中心區(qū)域運動距離(distance in center)和中心區(qū)域進(jìn)入次數(shù)(numbers of center entries)[19]。計算中心區(qū)域運動距離百分比,中心區(qū)域運動距離百分比(%)=中心區(qū)域運動距離/活動總距離×100%。實驗時,將小鼠面壁放在實驗箱一角,視頻記錄5 min內(nèi)小鼠在曠場實驗箱中的活動。曠場區(qū)域被等分為16格,其中中央4格定義為中心區(qū),其余為外圍區(qū),實驗時保證區(qū)域四角光線均勻。每只小鼠實驗結(jié)束后均用50%乙醇擦拭箱底,以免氣味干擾。

    1.5 創(chuàng)傷線索回避實驗檢測小鼠探索物體的時間

    在完成足底電擊后第2天和第29天進(jìn)行實驗。本實驗原理同埋球?qū)嶒炏嗨?,利用小鼠對新物體具有探索欲望的特性,但是物體作為創(chuàng)傷線索引起小鼠的恐懼情緒會阻止小鼠對物體進(jìn)行探索。先將作為創(chuàng)傷線索的純黑色物體A放入自主活動性實驗箱中(箱體中光強控制在30 lm),之后將小鼠貼壁放入實驗箱中自由探索10 min,當(dāng)小鼠面向物體,且鼻子主動嗅探物體或貼近物體周圍2 cm范圍即視為小鼠探索物體。記錄小鼠探索物體的時間,以反映小鼠的主動回避行為。每只小鼠實驗結(jié)束后,用50%乙醇擦拭箱體和物體,以消除前一只小鼠的氣味干擾。

    1.6 情景恐懼實驗檢測小鼠僵直時間[20]

    在完成應(yīng)激后第3天和第30天將小鼠重置電擊箱中10 min。電擊箱環(huán)境與小鼠應(yīng)激時完全一致,但不施加電擊刺激。記錄小鼠僵直時間(除呼吸引起的極其微弱的起伏外,身體一動不動定義為僵直狀態(tài)),以反映小鼠的再體驗行為。

    1.7 行為特征分析

    在行為特征分析中,選取曠場實驗中的中心區(qū)域運動距離百分比、創(chuàng)傷線索回避實驗中的探索物體時間和情景恐懼實驗中的僵直時間作為篩選指標(biāo)。模型組小鼠的數(shù)據(jù)與正常對照組的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。若中心區(qū)域運動距離百分比低于正常對照的(-1/2s)值,則表示小鼠出現(xiàn)焦慮樣癥狀;探索物體時間或僵直時間高于正常對照組(+1/2s)值,則表示小鼠出現(xiàn)再體驗癥狀或主動回避癥狀,當(dāng)小鼠同時具有上述3個癥狀判定為ASD或PTSD小鼠[17]。

    1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

    2 結(jié)果

    2.1 足底電擊對急性期和慢性期小鼠焦慮樣行為的影響和行為特征分析

    曠場實驗結(jié)果表明,電擊結(jié)束后第1天,與正常對照組相比,模型組(n=26)的總活動距離明顯減少(P<0.01)(圖2A),中心區(qū)域運動時間(P<0.01)(圖2B)、中心區(qū)域進(jìn)入次數(shù)(P<0.01)(圖2C)、中心區(qū)域運動距離(P<0.01)(圖2D)和中心區(qū)域運動距離百分比(P<0.01)(圖2E)顯著降低,提示電擊后第1天,即ASD階段小鼠出現(xiàn)了焦慮樣行為。至電擊后第28天,與正常對照組(n=25)相比,模型組總運動距離明顯減少(P<0.05),提示探索行為異常未恢復(fù);但其他指標(biāo)均已無明顯差異,提示電擊后28 d,即PTSD階段小鼠焦慮樣行為已基本消失,說明提示隨著時間的推移,小鼠的焦慮樣行為逐漸消退。

    將電擊結(jié)束后第1天小鼠中心區(qū)域運動距離百分比進(jìn)行升序排列,并與電擊結(jié)束后第28天各小鼠相應(yīng)指標(biāo)進(jìn)行對應(yīng)(圖2F)。結(jié)果顯示,正常對照組(r=0.31,P=0.12)(圖2G)小鼠在電擊結(jié)束后第1天和電擊結(jié)束后第28天中心區(qū)域運動距離百分比之間無明顯相關(guān)性,模型組(r=-0.08,P=0.68)(圖2H)不存在相關(guān)性。提示在ASD和PTSD階段小鼠所表現(xiàn)的焦慮樣行為無明顯關(guān)聯(lián)。

    Fig.2 Effects of foot-shock on the related indexes of anxiety-like behavior in acute stress phase(the 1stday)and chronic stress phase(the 28thday)of mice by OFT.See Fig.1 for the legend.Percentage of distance in center(%)=distance in center/overall distance×100%.1stday threshold:(-1/2 s)of the normal control group′s percentage of distance in center(%)1 d after foot-shock;28thday threshold:(-1/2 s)of the normal control group′s percentage of distance in center(%)28 d after foot-shock.F:serial numbers from 1 to 25 were the mice of normal control group and 26-51 were the mice of model group.±s,n=25-26.*P<0.05,**P<0.01,compared with normal control group.

    行為學(xué)特征分析結(jié)果表明,正常對照組在電擊結(jié)束后第1天和第28天均有7只焦慮樣小鼠。模型組在電擊結(jié)束后第1天有20只焦慮樣小鼠,第28天減少到10只,其中有1只小鼠從無焦慮樣癥狀發(fā)展為有癥狀,有12只小鼠從有焦慮樣癥狀發(fā)展為無癥狀。

    2.2 足底電擊對急性期和慢性期小鼠物體的探索時間的影響和行為特征分析

    創(chuàng)傷線索回避實驗結(jié)果顯示,足底電擊結(jié)束后第2天,正常對照組小鼠物體的探索時間為(43±27)s,模型組為(20±21)s,明顯降低(P<0.01),提示產(chǎn)生明顯的主動回避行為。電擊結(jié)束后第29天,正常對照組小鼠物體的探索時間為(48±21)s,模型組為(17±19)s,明顯降低(P<0.01),提示回避行為依舊存在(圖3A)。

    將電擊結(jié)束后第2天小鼠探索時間進(jìn)行升序排列,并與應(yīng)激后29天各小鼠相應(yīng)指標(biāo)進(jìn)行對應(yīng)(圖3B),分析小鼠電擊結(jié)束后第2天和第29天探索時間的相關(guān)性。結(jié)果顯示,正常對照組小鼠(r=0.09,P=0.66)(圖3C)電擊結(jié)束后第1天的探索時間同第29天無明顯相關(guān)性,而模型組小鼠(r=0.50,P<0.01)(圖3D)呈現(xiàn)中等強度的相關(guān)性,提示在ASD和PTSD階段小鼠所表現(xiàn)的主動回避行為呈正相關(guān)。

    Fig.3 Effects of foot-shock on the exploration time in acute stress phase(the 2ndday)and chronic stress phase(the 29thday)of mice by TCAT.See Fig.1 for the lengend.2ndday threshold:(-1/2 s)of the normal control group′s exploring time 2 d after foot-shock;29thday threshold:(-1/2 s)of the normal control group′s exploring time 29 d after foot-shock.±s,n=25-26.**P<0.01,compared with normal control group.

    行為學(xué)特征分析結(jié)果表明,正常對照組在電擊結(jié)束后第2天和應(yīng)激后第29天分別有8只和7只小鼠出現(xiàn)回避癥狀。模型組有19只小鼠在電擊結(jié)束后第2天出現(xiàn)回避癥狀,在第29天上升到23只,其中4只從電擊結(jié)束后第2天無回避癥狀發(fā)展到出現(xiàn)回避癥狀。

    2.3 足底電擊對急性期和慢性期小鼠僵直時間的影響和行為特征分析

    情景恐懼實驗結(jié)果顯示,電擊結(jié)束后第3天,正常對照組小鼠的僵直時間為(82±58)s,模型組為(202±82)s,明顯升高(P<0.01),提示產(chǎn)生明顯的再體驗癥狀。電擊結(jié)束后第30天,正常對照組小鼠的僵直時間為(106±44)s,模型組為(142±71)s,明顯升高(P<0.05),提示再體驗行為依舊存在(圖4A)。

    將應(yīng)激后第3天小鼠僵直時間進(jìn)行升序排列,并與應(yīng)激后30 d各小鼠相應(yīng)指標(biāo)進(jìn)行對應(yīng)(圖4B)。進(jìn)而分析應(yīng)激后第3天和第30天僵直時間的相關(guān)性,旨在了解小鼠再體驗行為隨時間推移的發(fā)展變化情況。結(jié)果顯示對照組小鼠(r=0.11,P=0.59)(圖4C)應(yīng)激后第3天的探索時間同第30天無明顯相關(guān)性,而模型組小鼠(r=0.72,P<0.01)(圖4D)呈現(xiàn)強相關(guān)性,提示在ASD和PTSD階段小鼠所表現(xiàn)的再體驗行為呈正相關(guān)。

    行為學(xué)特征分析結(jié)果顯示,正常對照組和模型組在應(yīng)激后第3天分別有5只和24只小鼠出現(xiàn)再體驗癥狀;在應(yīng)激后第30天,對照組和模型組中出現(xiàn)再體驗癥狀的小鼠數(shù)量分別為8只和14只。模型組中有10只小鼠從有再體驗癥狀發(fā)展到無癥狀;無小鼠從無癥狀發(fā)展到出現(xiàn)癥狀。

    2.4 小鼠ASD、PTSD發(fā)生率及ASD向PTSD發(fā)展分析

    行為特征分析小鼠ASD和PTSD患病率結(jié)果顯示,正常對照組小鼠(n=25)在急性期和慢性期的患病率分別為4.0%和8.0%。模型組小鼠(n=26)在急性期的患病率達(dá)到57.7%,隨時間推移在30 d后下降到30.8%。應(yīng)激后急性期有1只模型組小鼠僅出現(xiàn)一種癥狀,同時這只小鼠并沒有發(fā)展為PTSD;模型組小鼠中有10只在急性期出現(xiàn)2種癥狀,其中有2只發(fā)展為PTSD;有15只模型組小鼠在急性期出現(xiàn)全部3種癥狀,即患有ASD,其中6只發(fā)展為PTSD。提示在應(yīng)激初期患有ASD的小鼠可能更易發(fā)展為PTSD。

    3 討論

    本研究結(jié)果顯示,模型小鼠在急性應(yīng)激期表現(xiàn)出明顯的焦慮樣行為,慢性應(yīng)激期其焦慮樣行為顯著恢復(fù),這種變化趨勢與文獻(xiàn)報道的應(yīng)激動物模型和臨床研究結(jié)果一致[22-23]。在情景恐懼和創(chuàng)傷線索回避方面,模型動物在急性期也表現(xiàn)出明顯的情景恐懼和主動回避行為,且在慢性期無明顯緩解,這也與已有研究的變化趨勢一致[24-25]。在臨床中,隨著時間的推移創(chuàng)傷暴露患者癥狀的變化情況一直是研究的重點。通過相關(guān)性分析可以看出,應(yīng)激后模型小鼠個體主動回避和再體驗癥狀在急、慢性期的嚴(yán)重程度呈現(xiàn)較強的正相關(guān)性,而焦慮無明顯相關(guān)性,說明應(yīng)激后個體在急性期主動回避和再體驗癥狀的嚴(yán)重程度可以預(yù)測慢性期癥狀的嚴(yán)重程度。作為創(chuàng)傷記憶的相關(guān)癥狀,個體在應(yīng)激后急性期呈現(xiàn)出嚴(yán)重的主動回避或再體驗癥狀會持續(xù)至慢性期、不易消退,這與創(chuàng)傷記憶難以消除是PTSD核心問題的現(xiàn)有主流理論相符[26]。這也提示對于應(yīng)激障礙的臨床干預(yù),應(yīng)該在創(chuàng)傷暴露后早期重點關(guān)注出現(xiàn)創(chuàng)傷記憶相關(guān)癥狀的患者,因為其癥狀長期持續(xù)的可能性更高。雖然,從整體上看模型動物在負(fù)性情緒、再體驗癥狀以及主動回避等行為種均表現(xiàn)出一致的變化趨勢并與已有研究結(jié)果一致,但是動物個體在暴露于應(yīng)激事件后可呈現(xiàn)出不同程度的創(chuàng)傷反應(yīng)[27-28]。所以,無法直接用群體平均值判定某一動物應(yīng)激障礙的發(fā)病情況,要判定個體動物的發(fā)病情況需要對動物應(yīng)激后個體行為指標(biāo)進(jìn)行分析。

    目前,用于動物應(yīng)激后個體行為學(xué)篩選的方法主要有2種:“cut-off behavioral criteria(CBC)”和“行為特征分析”。CBC是通過選擇特定的標(biāo)準(zhǔn)來篩選行為學(xué)中表現(xiàn)極端的個體。如Cohen等[29]用高架十字迷宮和聽覺驚跳反射2個行為學(xué)實驗,選取開臂進(jìn)入次數(shù)為0和平均驚嚇幅度大于1200個單位作為CBC,同時符合2項標(biāo)準(zhǔn)的大鼠即為“適應(yīng)不良”。結(jié)果顯示,隨著時間的推移,應(yīng)激適應(yīng)不良的患病率從應(yīng)激后第1天的90%下降到7 d后的25%,并保持到應(yīng)激后第30天不變。使用CBC進(jìn)行篩選能夠進(jìn)一步提升模型的表觀效度,但CBC的標(biāo)準(zhǔn)是應(yīng)激群體中個體對應(yīng)激反應(yīng)的偏差,而臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)是基于正常人群的偏差[30]。為了更加接近臨床的診斷,有多個研究者[17,31-32]對CBC法進(jìn)行了改良,開發(fā)了一種新的篩選方法——行為特征分析。行為特征分析是將未應(yīng)激的對照組的行為表現(xiàn)作為定義界限的基礎(chǔ),確定的截止標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)保證多數(shù)正常動物處于正常范圍,然后基于截止標(biāo)準(zhǔn)對所有組別的動物進(jìn)行分析,把偏離截止標(biāo)準(zhǔn)的動物定義為“患病”個體。此外,行為特征分析還需要同時采用多個行為學(xué)指標(biāo),被定義為行為學(xué)極端個體的動物需要在多個參數(shù)中均超過臨界點,而不僅僅是一個參數(shù)。同時,行為特征分析的原則是以對照組作為篩選標(biāo)準(zhǔn),使用此方法可以消除多次行為學(xué)實驗本身對動物的影響。

    行為特征分析結(jié)果顯示,模型組小鼠急性應(yīng)激期和慢性應(yīng)激期的患病率分別約有57.7%和30.8%,這個患病率的時間序列特征與Bonanno等[32]使用CBC法后的發(fā)現(xiàn)類似,也同臨床數(shù)據(jù)具有一致性。臨床數(shù)據(jù)顯示,在應(yīng)激后被診斷為ASD的患者中有超過50%最終發(fā)展為PTSD,而在初期不符合ASD診斷依據(jù)的人群只有大約10%發(fā)展為PTSD[8]。在研究中,急性期同時符合3個ASD癥狀的15只小鼠中有6只在慢性期被診斷為PTSD,占比40%;急性期符合2個ASD癥狀的10只小鼠中只有2只發(fā)展為PTSD,占比20%;急性應(yīng)激期符合1個ASD癥狀標(biāo)準(zhǔn)的只有1只小鼠,在慢性應(yīng)激期沒有被診斷為PTSD。本研究結(jié)果提示,應(yīng)激后早期患有ASD的小鼠發(fā)展為PTSD的概率高于沒有ASD的小鼠,這一現(xiàn)象也與臨床數(shù)據(jù)相符。

    綜上所述,本研究成功建立了連續(xù)3 d足底電擊致小鼠ASD向PTSD發(fā)展的模型。此模型較好地模擬了ASD和PTSD的臨床癥狀、患病率和不同時期的狀態(tài)變化,此模型有可能用于ASD向PTSD發(fā)病機(jī)制的研究和防治應(yīng)激障礙的藥物篩選評價。

    猜你喜歡
    電擊特征分析急性期
    戶外照明電擊防護(hù)的幾點建議
    KD患兒急性期h-FABP、PAC-1表達(dá)與冠狀動脈受損的關(guān)系
    超級電擊武器
    2012 年南海夏季風(fēng)特征分析
    電擊武器的非致命效應(yīng)研究
    基于PowerPC的脈內(nèi)特征分析算法的工程實現(xiàn)
    DWI結(jié)合ADC圖在超急性期腦梗死診斷中的臨床應(yīng)用評價
    丹紅注射液治療腦梗塞急性期52例
    中西醫(yī)結(jié)合治療小兒咳嗽變異性哮喘急性期61例
    不良汽車駕駛行為特征分析
    河南科技(2014年16期)2014-02-27 14:13:27
    韩国av在线不卡| 看免费成人av毛片| 国产亚洲欧美精品永久| 亚洲av日韩在线播放| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 精品亚洲成a人片在线观看| 亚洲精品日本国产第一区| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 777米奇影视久久| 哪个播放器可以免费观看大片| 不卡视频在线观看欧美| 九九爱精品视频在线观看| 国产成人aa在线观看| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 亚洲国产精品一区三区| 极品人妻少妇av视频| 2022亚洲国产成人精品| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 秋霞伦理黄片| 美女视频免费永久观看网站| 国产免费视频播放在线视频| 国产欧美亚洲国产| a级片在线免费高清观看视频| 日日啪夜夜爽| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 日韩av免费高清视频| 免费高清在线观看视频在线观看| 两个人的视频大全免费| 免费av不卡在线播放| 久久久久久久亚洲中文字幕| 免费看av在线观看网站| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 国产精品99久久久久久久久| 在线观看人妻少妇| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 国产精品伦人一区二区| 亚洲国产精品成人久久小说| 午夜福利影视在线免费观看| 国产免费视频播放在线视频| 一区二区三区四区激情视频| 国产高清国产精品国产三级| 国产精品三级大全| 3wmmmm亚洲av在线观看| 日本与韩国留学比较| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 一级片'在线观看视频| 国产黄色免费在线视频| 国产免费一级a男人的天堂| 亚洲精品视频女| 人妻夜夜爽99麻豆av| 亚洲av国产av综合av卡| 天天操日日干夜夜撸| 九草在线视频观看| 亚洲电影在线观看av| 成人亚洲欧美一区二区av| 黄色配什么色好看| 亚洲无线观看免费| 国产乱人偷精品视频| 一级av片app| 如何舔出高潮| 国产精品久久久久久久久免| 日韩一区二区三区影片| 最后的刺客免费高清国语| 国产免费视频播放在线视频| 久久午夜综合久久蜜桃| 中国三级夫妇交换| 日韩精品有码人妻一区| 国产亚洲5aaaaa淫片| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 大话2 男鬼变身卡| 人妻夜夜爽99麻豆av| 免费高清在线观看视频在线观看| 婷婷色麻豆天堂久久| 22中文网久久字幕| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 性高湖久久久久久久久免费观看| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 18+在线观看网站| 欧美一级a爱片免费观看看| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 久久久久久久国产电影| 色视频www国产| 少妇 在线观看| 国内精品宾馆在线| 一本大道久久a久久精品| 一区二区三区免费毛片| 午夜老司机福利剧场| 美女福利国产在线| 免费av中文字幕在线| 国产高清国产精品国产三级| 欧美国产精品一级二级三级 | 亚洲人与动物交配视频| 亚洲国产色片| 成年人午夜在线观看视频| 午夜91福利影院| 人人澡人人妻人| 伦理电影免费视频| 一级片'在线观看视频| 国产男人的电影天堂91| 少妇的逼好多水| av在线播放精品| 夫妻午夜视频| 黑人高潮一二区| av免费观看日本| 久久99精品国语久久久| 日韩欧美 国产精品| 熟女电影av网| 欧美日韩综合久久久久久| 免费人妻精品一区二区三区视频| 97超视频在线观看视频| 黑人高潮一二区| 亚洲av福利一区| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 99精国产麻豆久久婷婷| 日本-黄色视频高清免费观看| 大陆偷拍与自拍| 美女大奶头黄色视频| 亚洲精品视频女| 各种免费的搞黄视频| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 国产精品嫩草影院av在线观看| 蜜桃久久精品国产亚洲av| kizo精华| 大话2 男鬼变身卡| 亚洲精品,欧美精品| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 日本av免费视频播放| 99久久精品热视频| 久久久国产一区二区| 久久久久人妻精品一区果冻| 一级毛片我不卡| 日韩亚洲欧美综合| 毛片一级片免费看久久久久| 日韩欧美精品免费久久| 国产成人免费无遮挡视频| 一级毛片我不卡| 最后的刺客免费高清国语| 好男人视频免费观看在线| 久久韩国三级中文字幕| 一二三四中文在线观看免费高清| 在线观看国产h片| 国产男女内射视频| 大码成人一级视频| 美女国产视频在线观看| 中国三级夫妇交换| 国内揄拍国产精品人妻在线| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 男女边吃奶边做爰视频| av国产久精品久网站免费入址| av国产精品久久久久影院| 日韩 亚洲 欧美在线| 免费黄频网站在线观看国产| 性高湖久久久久久久久免费观看| 在线精品无人区一区二区三| 日本欧美视频一区| av有码第一页| 久久99蜜桃精品久久| 午夜久久久在线观看| 国精品久久久久久国模美| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 亚洲在久久综合| 精品人妻偷拍中文字幕| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 国产男女内射视频| 日韩欧美精品免费久久| 晚上一个人看的免费电影| 精品一区二区三卡| 老司机影院毛片| 少妇人妻一区二区三区视频| 各种免费的搞黄视频| 色视频在线一区二区三区| av女优亚洲男人天堂| 国产91av在线免费观看| 精品少妇黑人巨大在线播放| 插逼视频在线观看| 中文天堂在线官网| 亚洲综合色惰| 男女国产视频网站| 国产老妇伦熟女老妇高清| 美女中出高潮动态图| 美女大奶头黄色视频| 五月玫瑰六月丁香| 亚洲欧美一区二区三区国产| 99re6热这里在线精品视频| 久久国产乱子免费精品| av不卡在线播放| 日韩一区二区视频免费看| 久久久午夜欧美精品| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 欧美3d第一页| 在线精品无人区一区二区三| 在线看a的网站| 街头女战士在线观看网站| 99久久精品热视频| 国产高清国产精品国产三级| 51国产日韩欧美| 青春草视频在线免费观看| 日韩在线高清观看一区二区三区| 亚洲精品久久午夜乱码| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 欧美成人精品欧美一级黄| 国产午夜精品一二区理论片| 男女啪啪激烈高潮av片| 成人国产av品久久久| 久久 成人 亚洲| 亚洲欧美清纯卡通| 内地一区二区视频在线| av视频免费观看在线观看| 国产精品.久久久| 美女主播在线视频| 国产精品女同一区二区软件| 久久99热这里只频精品6学生| 18禁在线播放成人免费| 精品国产国语对白av| 特大巨黑吊av在线直播| 国产伦理片在线播放av一区| 三级国产精品欧美在线观看| 美女国产视频在线观看| av卡一久久| 国产精品久久久久久久久免| 免费看光身美女| 亚洲一区二区三区欧美精品| 久久人人爽人人爽人人片va| 成年人午夜在线观看视频| 免费少妇av软件| 99视频精品全部免费 在线| 国产一区二区在线观看av| 毛片一级片免费看久久久久| 国产精品蜜桃在线观看| 国产成人freesex在线| 亚洲av男天堂| 麻豆乱淫一区二区| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 久久久久国产精品人妻一区二区| av.在线天堂| 日本av手机在线免费观看| 日韩视频在线欧美| 七月丁香在线播放| 妹子高潮喷水视频| 日韩av不卡免费在线播放| 99久久综合免费| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 日本黄大片高清| av免费观看日本| 国产精品久久久久成人av| 国产毛片在线视频| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 亚洲精品中文字幕在线视频 | 熟女av电影| 日韩人妻高清精品专区| 婷婷色综合www| 久久精品国产亚洲av涩爱| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 青春草国产在线视频| 成人亚洲欧美一区二区av| 国产亚洲最大av| 如何舔出高潮| 国产精品偷伦视频观看了| 在线观看免费高清a一片| 夜夜爽夜夜爽视频| 日韩制服骚丝袜av| 免费看日本二区| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 亚洲欧美清纯卡通| 国产高清不卡午夜福利| 日日摸夜夜添夜夜爱| 一区二区三区乱码不卡18| 日韩一区二区视频免费看| 少妇人妻久久综合中文| 成人二区视频| 亚洲av国产av综合av卡| 国产精品一区www在线观看| 黑丝袜美女国产一区| 日本av手机在线免费观看| 久热这里只有精品99| 亚洲av.av天堂| 国产69精品久久久久777片| 国产精品.久久久| 亚洲精品国产色婷婷电影| 99热这里只有是精品50| 少妇人妻 视频| 啦啦啦啦在线视频资源| 亚洲精品自拍成人| 99久久精品国产国产毛片| 日本黄色日本黄色录像| 国产高清国产精品国产三级| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 日韩av免费高清视频| 亚洲图色成人| 最黄视频免费看| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 你懂的网址亚洲精品在线观看| av天堂久久9| 99热这里只有是精品50| 亚洲av.av天堂| 嘟嘟电影网在线观看| 日韩av在线免费看完整版不卡| 性色avwww在线观看| 大香蕉久久网| 嫩草影院新地址| 欧美97在线视频| 久久久久久久久大av| 久久久久久久大尺度免费视频| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 精品国产国语对白av| 久久久久久久久久成人| 天堂8中文在线网| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 人人妻人人澡人人看| 国产精品国产三级国产专区5o| 国产熟女欧美一区二区| 久久午夜福利片| 国产毛片在线视频| 亚洲精品国产成人久久av| 成人综合一区亚洲| 一级片'在线观看视频| 精品亚洲成国产av| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 男人狂女人下面高潮的视频| 一区二区三区精品91| 久久久久精品性色| 国产在线免费精品| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 成人综合一区亚洲| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 十八禁高潮呻吟视频 | tube8黄色片| 日韩制服骚丝袜av| 日日啪夜夜爽| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 亚洲精品456在线播放app| 免费高清在线观看视频在线观看| 国产乱来视频区| 日韩av不卡免费在线播放| 国产老妇伦熟女老妇高清| 最近中文字幕2019免费版| 亚洲,一卡二卡三卡| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 国产男女内射视频| 久久久精品免费免费高清| 亚洲精品色激情综合| 精品亚洲成国产av| 亚州av有码| 亚洲av在线观看美女高潮| 国产欧美日韩综合在线一区二区 | 男女边摸边吃奶| 大香蕉97超碰在线| 亚洲电影在线观看av| 一本一本综合久久| 中文字幕人妻丝袜制服| 99久久综合免费| 亚洲中文av在线| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 国产一区二区三区综合在线观看 | 亚洲国产欧美在线一区| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 久久久a久久爽久久v久久| 精品久久久久久电影网| 乱码一卡2卡4卡精品| 亚洲美女视频黄频| 亚洲av不卡在线观看| 欧美日韩在线观看h| 久久人人爽人人片av| 精品人妻偷拍中文字幕| 久久人人爽人人片av| 亚洲av中文av极速乱| 黄色视频在线播放观看不卡| 亚洲精品亚洲一区二区| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 日韩一本色道免费dvd| 曰老女人黄片| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 黄色视频在线播放观看不卡| 婷婷色麻豆天堂久久| 亚洲精品成人av观看孕妇| 美女大奶头黄色视频| 精品人妻熟女av久视频| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 久久久久网色| 成人毛片60女人毛片免费| 国产淫片久久久久久久久| 国产熟女欧美一区二区| 91在线精品国自产拍蜜月| a级一级毛片免费在线观看| 欧美少妇被猛烈插入视频| 亚洲人成网站在线观看播放| 国产高清国产精品国产三级| 内射极品少妇av片p| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 久久精品国产亚洲av涩爱| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 黄色配什么色好看| 亚洲国产最新在线播放| 精品国产露脸久久av麻豆| 中文字幕精品免费在线观看视频 | www.av在线官网国产| 91精品国产国语对白视频| 女人久久www免费人成看片| 六月丁香七月| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 精品一品国产午夜福利视频| 成人影院久久| 欧美人与善性xxx| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 久久精品国产亚洲av涩爱| 国产高清有码在线观看视频| 免费大片黄手机在线观看| 午夜免费鲁丝| 国产精品一区二区在线观看99| 最后的刺客免费高清国语| 天堂中文最新版在线下载| 男人爽女人下面视频在线观看| 成人毛片60女人毛片免费| 日韩 亚洲 欧美在线| 男女啪啪激烈高潮av片| 免费看日本二区| 最新中文字幕久久久久| 97在线人人人人妻| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 国产av一区二区精品久久| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 亚洲国产色片| 国产精品福利在线免费观看| 国产爽快片一区二区三区| 亚洲国产精品专区欧美| 99热这里只有是精品50| av一本久久久久| 伦精品一区二区三区| 国精品久久久久久国模美| 亚洲成色77777| 高清欧美精品videossex| 男的添女的下面高潮视频| 麻豆乱淫一区二区| 26uuu在线亚洲综合色| 成年av动漫网址| 极品人妻少妇av视频| 久久久国产欧美日韩av| 日韩av免费高清视频| 蜜桃在线观看..| 久久青草综合色| 欧美最新免费一区二区三区| 国产片特级美女逼逼视频| 国产精品一区二区性色av| 少妇 在线观看| 久久99蜜桃精品久久| 午夜精品国产一区二区电影| 亚洲精品乱久久久久久| av专区在线播放| 亚洲中文av在线| 亚洲综合精品二区| 国产免费一级a男人的天堂| 久久久久精品性色| 午夜av观看不卡| 亚洲成人一二三区av| 精品国产一区二区久久| 日韩电影二区| 久久久亚洲精品成人影院| 国产精品嫩草影院av在线观看| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 午夜精品国产一区二区电影| 爱豆传媒免费全集在线观看| 欧美高清成人免费视频www| 久久青草综合色| 国产在线免费精品| 亚洲av免费高清在线观看| 成人毛片a级毛片在线播放| 国产片特级美女逼逼视频| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 熟妇人妻不卡中文字幕| 一区在线观看完整版| 极品少妇高潮喷水抽搐| a级毛片免费高清观看在线播放| 午夜福利,免费看| 六月丁香七月| 国产成人精品无人区| 在线免费观看不下载黄p国产| 国产黄色免费在线视频| 午夜精品国产一区二区电影| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 大片免费播放器 马上看| 高清黄色对白视频在线免费看 | 国产成人91sexporn| 国产色婷婷99| 丰满迷人的少妇在线观看| h日本视频在线播放| 2021少妇久久久久久久久久久| 国产永久视频网站| 99热6这里只有精品| 在线观看av片永久免费下载| 国产精品一区www在线观看| 亚洲欧美精品自产自拍| 嫩草影院入口| 久久久久国产网址| 国产高清国产精品国产三级| 午夜免费男女啪啪视频观看| 97在线视频观看| 另类亚洲欧美激情| 国产视频首页在线观看| 欧美高清成人免费视频www| 综合色丁香网| 九草在线视频观看| 国产av国产精品国产| 午夜福利,免费看| 一级毛片久久久久久久久女| 午夜福利,免费看| 日韩强制内射视频| 日韩在线高清观看一区二区三区| 欧美另类一区| 国产又色又爽无遮挡免| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 国产午夜精品一二区理论片| 亚洲精品国产色婷婷电影| 亚洲人成网站在线观看播放| 97超视频在线观看视频| 18禁动态无遮挡网站| 免费看光身美女| 久久韩国三级中文字幕| 插逼视频在线观看| 大香蕉97超碰在线| 国产免费福利视频在线观看| 在线 av 中文字幕| 亚洲av日韩在线播放| 久久国内精品自在自线图片| 成人亚洲精品一区在线观看| 免费大片18禁| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 亚洲国产精品一区三区| 午夜免费男女啪啪视频观看| 国产日韩一区二区三区精品不卡 | 超碰97精品在线观看| 中文欧美无线码| 妹子高潮喷水视频| 欧美日韩精品成人综合77777| 丰满饥渴人妻一区二区三| 91aial.com中文字幕在线观看| 国产精品一二三区在线看| 又爽又黄a免费视频| 久久久久久久久久久免费av| av国产精品久久久久影院| 国产在线视频一区二区| 国产黄片视频在线免费观看| 国产伦在线观看视频一区| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 麻豆精品久久久久久蜜桃| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 免费看av在线观看网站| 五月伊人婷婷丁香| 国产深夜福利视频在线观看| 亚洲美女视频黄频| videos熟女内射| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 日本欧美视频一区| 少妇的逼好多水| 成人午夜精彩视频在线观看| 国产精品免费大片| 日韩成人伦理影院| 国产高清有码在线观看视频| 成人免费观看视频高清| 国产精品熟女久久久久浪| 日韩av在线免费看完整版不卡| 免费看av在线观看网站| 五月玫瑰六月丁香| av有码第一页| 亚洲精品成人av观看孕妇| 我的女老师完整版在线观看| 亚洲在久久综合| 国产精品久久久久久精品电影小说| av福利片在线| 久久久欧美国产精品| 日韩免费高清中文字幕av| 日本色播在线视频| 久热这里只有精品99| 亚洲国产最新在线播放| 深夜a级毛片| 日本91视频免费播放| 亚洲情色 制服丝袜| 三级国产精品欧美在线观看| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 国产精品一区二区在线不卡| 高清午夜精品一区二区三区| 如何舔出高潮| 激情五月婷婷亚洲| 黑丝袜美女国产一区| 婷婷色av中文字幕| 亚洲av福利一区| 久久久国产精品麻豆| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 爱豆传媒免费全集在线观看| 黄色一级大片看看| 久久精品夜色国产| 亚洲精品乱久久久久久| 大香蕉久久网| 日韩一区二区三区影片| 国产亚洲91精品色在线| 成年人免费黄色播放视频 | 精品国产露脸久久av麻豆| 国产一级毛片在线| 欧美少妇被猛烈插入视频| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 晚上一个人看的免费电影| 成人特级av手机在线观看| av.在线天堂| 成年av动漫网址| 9色porny在线观看| 欧美xxⅹ黑人| 高清毛片免费看| 亚洲国产精品一区三区| 成人毛片60女人毛片免费| 97在线人人人人妻| av在线播放精品| 免费高清在线观看视频在线观看| 中文字幕久久专区|