Percoll分離法聯(lián)合MALDI-TOF MS直接鑒定血培養(yǎng)專性厭氧菌陽性標(biāo)本的應(yīng)用價值*

梁 林，幸 雯，張 京，陸必超，丁秀榮，劉志忠△

1.首都醫(yī)科大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院，北京 100069；2.中國康復(fù)研究中心北京博愛醫(yī)院檢驗科，北京 100068;3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院檢驗科，北京 100069

厭氧菌廣泛分布于人體皮膚及各種腔道的深部黏膜表面，在機體免疫力受損、深部組織損傷或者需氧菌感染等情況下，會誘發(fā)感染。厭氧菌所致的血流感染約占臨床血流感染的1%～17%，并且具有較高的致死率[1-2]。對厭氧菌及時準(zhǔn)確的鑒定對優(yōu)化抗菌藥物治療、改善患者預(yù)后至關(guān)重要，但傳統(tǒng)的厭氧菌鑒定方法所需時間至少為48 h，嚴(yán)重阻礙了臨床對感染的控制和治療?；|(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)是近年發(fā)展起來的一種細菌鑒定技術(shù)，不僅可對純培養(yǎng)的菌落進行鑒定，還可對培養(yǎng)呈陽性的血液、尿液等體液標(biāo)本進行直接鑒定，明顯縮短了鑒定時間。但目前，應(yīng)用MALDI-TOF MS對血培養(yǎng)陽性標(biāo)本進行直接檢測的文獻主要涉及各種需氧菌、兼性厭氧菌和真菌的檢測[3-6]，很少涉及專性厭氧菌的檢測[1-2,7]。本實驗室采用細胞分離液(Percoll液)密度梯度離心的方法(簡稱Percoll分離法)分離、富集專性厭氧菌用于MALDI-TOF MS的直接檢測，并與十二烷基硫酸鈉(SDS)洗滌法進行比較分析，旨在對兩種不同前處理方法的鑒定準(zhǔn)確率進行比較?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1材料來源 收集2018年3月至2020年9月中國康復(fù)研究中心北京博愛醫(yī)院和首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院血培養(yǎng)單獨厭氧瓶陽性的標(biāo)本。同一患者送檢多套標(biāo)本則只選擇最早報陽的厭氧瓶。本研究僅匯總了經(jīng)鑒定為專性厭氧菌的檢測結(jié)果。

1.1.2儀器與試劑 MicroflexTMMALDI-TOF MS儀和Biotyper 3.1鑒定分析軟件、基質(zhì)液、甲酸、96孔金屬靶板均購自德國Bruker Daltonik公司；BACTECTM FX血培養(yǎng)儀及配套培養(yǎng)瓶購自美國BD公司；0.05%SDS溶液購自美國Sigma公司；Percoll細胞分離液購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2方法

1.2.1菌種鑒定 血培養(yǎng)標(biāo)本培養(yǎng)報陽后立即取出厭氧菌培養(yǎng)瓶，染色鏡檢，同時進行MALDI-TOF MS直接檢測和傳統(tǒng)的培養(yǎng)鑒定流程。

1.2.2Percoll分離法 在王瑞霞等[8]方法的基礎(chǔ)上進行了相應(yīng)的改進。抽取3 mL培養(yǎng)瓶內(nèi)容物和3 mL生理鹽水移入15 mL離心管混勻，1 000 r/min離心10 min，移上清液(含待測菌)至另一離心管內(nèi)，5 000 r/min，離心5 min，棄上清液，加超純水0.4 mL，轉(zhuǎn)移到5 mL離心管中(事先加入2 mL Percoll液，體積比Percoll∶NaCl=3∶7)，5 000 r/min離心5 min，棄去上清液，余下液體轉(zhuǎn)移至2 mL平底 EP管，13 000 r/min離心2 min，棄上清液，超純水重復(fù)洗滌2次至清亮。

1.2.3SDS洗滌法 在MENGLAN等[3]方法的基礎(chǔ)上進行了一定的修改。抽取3 mL培養(yǎng)瓶內(nèi)容物和3 mL生理鹽水移入15 mL離心管混勻，1 000 r/min離心10 min，移上清液(含待測菌)至另一離心管內(nèi)，加入1 mL 0.05% SDS溶液，顛倒混勻，5 000 r/min，離心5 min，棄上清液，加超純水1.5 mL混勻后移至2 mL平底 EP管，13 000 r/min離心2 min，棄上清液，重復(fù)洗滌2次，盡量排干多余水分。

1.2.4直接鑒定 吸取1 μL富集的菌體涂布于96孔金屬靶板上，室溫干燥；加入70%甲酸1 μL，室溫干燥；加基質(zhì)液1 μL覆蓋，室溫干燥，將靶板放到MALDI-TOF MS質(zhì)譜儀上，應(yīng)用Biotyper 3.1鑒定分析軟件進行鑒定，記錄鑒定結(jié)果和分值。

1.2.5傳統(tǒng)培養(yǎng)鑒定 將報陽標(biāo)本轉(zhuǎn)種至血瓊脂平板和麥康凱瓊脂平板上，厭氧環(huán)境，35 ℃孵育24～48 h。獲得純菌落后，用MALDI-TOF MS進行鑒定。分值量化判定結(jié)果：評分≥2.0鑒定到“種”；1.7≤評分<2.0鑒定到“屬”；評分<1.7則未鑒定出。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料以頻數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1患者一般資料和菌株傳統(tǒng)鑒定方法結(jié)果 研究期間共有578瓶血培養(yǎng)厭氧瓶陽性，經(jīng)鑒定其中81瓶為單一菌種的專性厭氧菌，由于9份標(biāo)本所得純菌落不能被儀器準(zhǔn)確鑒定而被舍棄，最終共有71份標(biāo)本納入了研究，其中50份來自首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院，21份來自中國康復(fù)研究中心北京博愛醫(yī)院。菌株來源的患者中男51例(71.8%)，女20例(28.2%)；年齡5～82歲，平均(55.7±15.3)歲。患者原發(fā)病依次為乙型肝炎肝硬化16例(22.5%)，肝癌14例(19.7%)，其他系統(tǒng)腫瘤11例(15.5%)，酒精性肝硬化6例(8.5%)，丙型肝炎肝硬化5例(7.0%)，肝膿腫5例(7.0%)，原發(fā)性膽汁性肝硬化3例(4.2%)，胰腺炎2例(2.8%)，高位截癱2例(2.8%)，產(chǎn)后感染2例(2.8%)，其他5例(7.0%)。71株菌株中革蘭陰性菌30株(42.3%)，包括陰性桿菌26株，陰性球菌4株；革蘭陽性菌41株(57.7%)，包括陽性桿菌30株，陽性球菌11株。

2.2經(jīng)Percoll分離法和SDS洗滌法處理后標(biāo)本MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果的比較 使用Percoll分離法處理標(biāo)本，“種”水平鑒定準(zhǔn)確率為84.5%，其中革蘭陰性菌的“種”水平鑒定準(zhǔn)確率為80.0%，革蘭陽性菌的“種”水平鑒定準(zhǔn)確率為87.8%。使用SDS洗滌法處理標(biāo)本，“種”水平鑒定準(zhǔn)確率為60.6%，其中革蘭陰性菌的“種”水平鑒定準(zhǔn)確率為46.7%，革蘭陽性菌的“種”水平鑒定準(zhǔn)確率為70.7%。見表1。

表1 經(jīng)Percoll分離法和SDS洗滌法處理后標(biāo)本MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果的比較[n(%)]

2.3經(jīng)Percoll分離法和SDS洗滌法處理后標(biāo)本MALDI-TOF MS鑒定各類病原菌結(jié)果比較 與SDS洗滌法相比，采用Percoll分離法處理標(biāo)本后MALDI-TOF MS對革蘭陰性桿菌的鑒定準(zhǔn)確率明顯增加(80.0%vs.46.7%,χ2=7.177,P=0.007)，特別是脆弱擬桿菌“種”水平鑒定準(zhǔn)確率由45.5%提高到100.0%。但兩種處理方法對普雷沃菌“屬”水平的細菌鑒定準(zhǔn)確率均不高。見表2。

表2 經(jīng)Percoll分離法和SDS洗滌法處理后標(biāo)本MALDI-TOF MS鑒定各類病原菌結(jié)果比較[n或n(%)]

續(xù)表2 經(jīng)Percoll分離法和SDS洗滌法處理后標(biāo)本MALDI-TOF MS鑒定各類病原菌結(jié)果比較[n或n(%)]

3 討 論

專性厭氧菌對培養(yǎng)及鑒定條件的要求十分苛刻[9]。傳統(tǒng)的生化鑒定技術(shù)因受多種因素的影響在厭氧菌的鑒定中鑒定率較低，鑒定周期較長，不能滿足臨床的要求[10-11]。MALDI-TOF MS是近年來新興的微生物鑒定技術(shù)，能快速、準(zhǔn)確地鑒定多種臨床常見的血培養(yǎng)專性厭氧菌。MALDI-TOF MS用于血培養(yǎng)厭氧菌陽性標(biāo)本的直接鑒定也有相關(guān)文獻報道[1-2,7]。

影響MALDI-TOF MS直接鑒定準(zhǔn)確率的關(guān)鍵因素是血培養(yǎng)瓶的種類和對菌液的預(yù)處理方法。與需氧培養(yǎng)瓶不同，臨床常用的厭氧瓶含有溶血素，能充分破壞血細胞，可減少血細胞對直接鑒定的影響。ALMUHAYAWI等[2]用去離子水直接洗滌血培養(yǎng)陽性標(biāo)本用于MALDI-TOF MS的厭氧菌鑒定，但由于培養(yǎng)瓶中其他干擾物質(zhì)的存在，其“屬”水平鑒定準(zhǔn)確率僅為76%左右。而采用目前常用于需氧瓶預(yù)處理的方法如Sepsityper試劑盒、分離膠促凝管、皂素溶解、濾膜吸附和SDS洗滌等方法來處理厭氧菌標(biāo)本其鑒定準(zhǔn)確率明顯低于需氧菌。JEVERICA等[1]采用Sepsityper試劑盒直接鑒定厭氧菌，其鑒定準(zhǔn)確率僅為56.3%，采用皂素溶解洗滌法則其鑒定準(zhǔn)確率為84.9%。王軍杰等[12]采用分離膠促凝管法，對厭氧菌的鑒定準(zhǔn)確率為66.7%，明顯低于對需氧瓶中細菌的鑒定準(zhǔn)確率。國外的研究者更傾向于采用SDS洗滌法來處理血培養(yǎng)陽性標(biāo)本用于MALDI-TOF MS的直接鑒定[13]。SDS是一種溫和去污劑，能夠輔助純化菌體，去除干擾因素，提高直接鑒定細菌的準(zhǔn)確率[13]。有研究發(fā)現(xiàn)，采用SDS洗滌法處理血培養(yǎng)陽性標(biāo)本用于鑒定厭氧瓶中細菌，其準(zhǔn)確率明顯高于分離膠促凝管法[6,14]。本研究采用SDS洗滌法處理的標(biāo)本用于MALDI-TOF MS直接檢測，其鑒定準(zhǔn)確率僅為62.5%。而且，在研究過程中筆者發(fā)現(xiàn)，盡管使用了較低濃度(0.05%)的SDS溶液來處理標(biāo)本，SDS仍會對部分革蘭陰性菌的形態(tài)產(chǎn)生影響，特別是脆弱擬桿菌在SDS的作用下會出現(xiàn)“黏液化”現(xiàn)象，從而聚集成團，嚴(yán)重影響細菌鑒定的準(zhǔn)確性。周春妹等[5]也發(fā)現(xiàn)，在使用SDS溶液洗滌后革蘭陰性菌的鑒定準(zhǔn)確率由92.3%下降至85.3%。這可能與細菌的細胞壁結(jié)構(gòu)差異有關(guān)，與革蘭陽性菌相比，革蘭陰性菌的細胞壁更薄，并含有較多的脂類和蛋白，可能更容易被SDS所破壞。

Percoll是一種包有乙烯吡咯烷酮的硅膠顆粒，不穿透生物膜，對細胞無毒害作用，常用于實驗室中細胞、細菌和病毒的分離[8,15]。本研究采用Percoll∶NaCl=3∶7的比例配制的Percoll液來分離、純化厭氧菌用于MALDI-TOF MS的直接鑒定，鑒定準(zhǔn)確率為84.7%，明顯高于SDS洗滌法，且高于JEVERICA等[1]Sepsityper試劑盒法結(jié)果，但與該研究的皂素溶解洗滌法結(jié)果相近。而在本研究脆弱擬桿菌的鑒定中，采用Percoll分離法時，其鑒定準(zhǔn)確率更是由SDS洗滌法的45.5%提高到100.0%。但與SDS洗滌法相比，Percoll分離法要增加洗滌過程，相對增加了實驗的繁復(fù)性，而且在洗滌過程中會造成部分菌體的丟失，使最終獲得的菌量少于SDS洗滌法。

綜上所述，采用Percoll分離法聯(lián)合MALDI-TOF MS直接鑒定血培養(yǎng)專性厭氧陽性標(biāo)本，具有操作簡單、結(jié)果準(zhǔn)確、縮短鑒定結(jié)果報告周期等優(yōu)勢，特別是Percoll分離法對提高MALDI-TOF MS 在革蘭陰性厭氧菌的鑒定準(zhǔn)確率中有較大幫助，值得在臨床微生物實驗室推廣。