ROS/JNK通路在槲皮素抑制異煙肼誘導肝細胞凋亡中的作用

陳廷玉，陳德順，何帥兵，易燕鋒，沈 洪，林鉅斌，盧春鳳

(1.湖州師范學院 醫(yī)學院，浙江 湖州313000；2.江南大學 物聯(lián)網(wǎng)工程學院，江蘇 無錫 214122)

據(jù)2020年WHO統(tǒng)計資料顯示，結核病在全球范圍內的發(fā)病率呈急劇上升趨勢，中國是結核病高發(fā)國之一.目前，結核病的治療仍以藥物治療為主.異煙肼(isoniazid，INH)是臨床上廣泛應用的一線抗結核藥物[1]，但因其嚴重的肝損傷限制了它的臨床應用，且嚴重影響了結核病的治療效果[2-6].因此，如何防治INH肝損傷已成為亟需解決的問題，尋找有效防治INH肝損傷的藥物也成為該領域的研究熱點.槲皮素(quercetin，Que)是黃酮類化合物，具有抗氧化、抗炎、抗凋亡、抗纖維化等多種藥理作用[7-9]，且使用安全，具有理想的臨床應用前景.我們前期研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素對INH誘導的肝細胞和大鼠肝損傷具有一定的保護作用，但其作用機制尚不清楚[10-12].研究表明，ROS/JNK通路在細胞分化、細胞凋亡、氧化應激反應的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[13].因此，本研究以人肝細胞L-02細胞為研究對象，重點探討ROS/JNK通路在槲皮素抑制INH誘導L-02細胞凋亡中的作用，進而闡明槲皮素對INH肝損傷的保護作用機制，以期為臨床尋找有效防治INH肝損傷的藥物提供實驗依據(jù).

1 材料與方法

1.1 細胞株與主要試劑

L-02細胞購自中國科學院上海細胞生物研究所；DMEM培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品；胎牛血清為Hyclone公司產(chǎn)品；異煙肼、槲皮素、DCFH-DA均為Sigma公司產(chǎn)品；MTT為Amresco公司產(chǎn)品；LDH活性檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；BCA蛋白定量試劑盒、Hoechst33258染色試劑盒、Caspase 3活性檢測試劑盒為杭州碧云天公司產(chǎn)品；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、PMSF為Merck公司產(chǎn)品；Super ECL為普利萊基因技術有限公司產(chǎn)品；p-JNK、β-actin多克隆抗體為Santa Cruz公司產(chǎn)品，辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔IgG為Zymed公司產(chǎn)品.

1.2 方法

1.2.1 L-02細胞培養(yǎng)與存活率檢測

L-02細胞用含青、鏈霉素雙抗及10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進行常規(guī)培養(yǎng).鏡下觀察細胞生長情況，取對數(shù)生長期的細胞進行實驗，加藥后換為不含血清的培養(yǎng)液進行培養(yǎng).將細胞隨機分為4組.對照組(Control)：給予等體積無血清培養(yǎng)基；INH組(INH)：給予10 mmol/L INH；槲皮素低劑量組(Que-L)：給予10 mmol/L INH+25 μmol/L槲皮素；槲皮素高劑量組(Que-H)：給予10 mmol/L INH+50 μmol/L槲皮素.首先將細胞接種于96孔板中，再按實驗分組進行處理，每組設3個平行孔，培養(yǎng) 24 h 后應用MTT法檢測L-02細胞存活率.在波長570 nm處用酶標儀測定每孔的吸光度(OD)值，并計算細胞相對存活率：

細胞相對存活率(%)=(OD樣品-OD本底)/(OD對照-OD本底)×100%.

1.2.2 LDH活性測定

將L-02細胞按實驗分組進行處理，每組設3個平行孔，培養(yǎng)24 h后應用比色法測定細胞上清液中LDH活性.吸取細胞培養(yǎng)液，離心，取上清液100 μL，加入50 μL蒸餾水和250 μL基質緩沖液，充分混勻，37 ℃孵育15 min，加入250 μL 2,4-Dinitrophenylhydrazine，混勻，37 ℃孵育15 min，加入2.5 mL氫氧化鈉，室溫放置，3 min后在波長440 nm處用酶標儀測定OD值，并計算LDH活性.

1.2.3 Hoechst 33258熒光染色法檢測細胞凋亡

將L-02細胞接種于用Poly-L-Lysine包被的培養(yǎng)皿中，按實驗分組對細胞進行處理，每組設3個平行孔，培養(yǎng)24 h后采用Hoechst 33258熒光染色法檢測細胞凋亡情況.具體按試劑盒說明進行操作：吸棄培養(yǎng)液，用PBS沖洗后加入500 μL固定液，4 ℃固定10 min，再用PBS沖洗，加入500 μL Hoechst 33258染色液，避光染色5 min，用PBS沖洗后加抗熒光淬滅劑，封片.在激發(fā)波長350 nm、發(fā)射波長460 nm下采用熒光顯微鏡觀察細胞凋亡情況，拍照并計算細胞凋亡率：

細胞凋亡率(%)=凋亡細胞數(shù)/計數(shù)的細胞總數(shù)×100%.

1.2.4 Caspase 3活性檢測

采用比色法檢測細胞裂解液中Caspase 3活性.首先按實驗分組處理細胞后收集細胞，然后用PBS洗滌細胞，加入100 μL細胞裂解液冰上裂解，離心，收集上清液.具體檢測方法按試劑盒說明書進行操作：取10 μL裂解上清液，加入90 μL檢測緩沖掖，再加入10 μL Ac-DEVD-pNA，37 ℃下避光反應1 h，用多功能酶標儀在400 nm處測定OD值，根據(jù)凋亡誘導的細胞OD值與空白對照細胞OD值的比值計算Caspase 3相對活性.

1.2.5 線粒體ROS水平測定

按實驗分組處理細胞后，收集各組細胞，采用差速離心法分離線粒體，并用HEPES緩沖液制成線粒體懸液，應用熒光探針DCFH-DA檢測細胞線粒體ROS水平.首先加入DCFH-DA，使其終濃度為2 μg/mL，37 ℃孵育30 min后，用冷PBS沖洗，然后在激發(fā)波長488 nm、發(fā)射波長525 nm下采用多功能酶標儀測定其熒光強度值.結果用相對值表示，即處理組熒光強度/對照組熒光強度×100%.

1.2.6 p-JNK蛋白表達水平檢測

采用Western blot技術檢測細胞中的p-JNK蛋白表達水平.首先將L-02細胞接種于培養(yǎng)瓶中，按實驗分組處理細胞后收集細胞，然后加入細胞裂解液在冰上裂解細胞，提取細胞蛋白，并用BCA法對蛋白濃度進行測定.每孔上樣10 μg總蛋白，在SDS-PAGE中進行電泳分離，然后將分離后的蛋白轉膜至PVDF膜上.用含5%脫脂奶粉的封閉液封閉，2 h后加入用封閉液稀釋的一抗(p-JNK、β-actin)，室溫孵育1 h后轉入4 ℃冰箱孵育過夜.第二天用TBST洗膜，然后加入二抗室溫再孵育1 h后TBST洗膜.在暗室中用Super ECL發(fā)光液檢測目標蛋白條帶，膠片曝光、顯影，并掃描膠片，用Quantity One 4.6.2圖像分析軟件對p-JNK蛋白表達進行分析，以β-actin作為內參.

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

2 結果與分析

2.1 槲皮素和INH對細胞存活率及LDH活性的影響

由圖1和圖2可見：L-02細胞經(jīng)INH處理后，與對照組相比，細胞存活率明顯降低，而細胞上清液中LDH活性明顯增高(P<0.01)，提示INH可能造成細胞膜損傷，導致LDH漏出到細胞外液中；與INH組相比，槲皮素高劑量組細胞存活率明顯增高，而經(jīng)槲皮素處理后細胞上清液中的LDH活性明顯降低(P<0.05或P<0.01)，表明槲皮素對INH誘導的細胞損傷具有保護作用，且高劑量組的保護作用更顯著.

注：與對照組比較，“**”表示P<0.01；與INH組比較，“#”表示P<0.05，“##”表示P<0.01.下同.

圖2 L-02細胞上清液中LDH活性

2.2 槲皮素和INH對細胞凋亡的影響

采用Hoechst 33258熒光染料將L-02細胞染色后，在熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡情況，可見INH組細胞胞漿濃縮、核染色質致密深染，且個別細胞發(fā)生了核固縮、核碎裂等凋亡形態(tài)學改變，而經(jīng)槲皮素處理后細胞凋亡形態(tài)明顯改善，見圖3.凋亡細胞數(shù)用凋亡百分率表示.由圖4可見：L-02細胞經(jīng)INH處理后，細胞凋亡率顯著增高，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，表明INH可誘導L-02細胞凋亡；經(jīng)槲皮素處理后細胞凋亡率明顯低于INH組(P<0.05或P<0.01)，表明槲皮素可抑制L-02細胞凋亡，且高劑量組對細胞凋亡的抑制作用更明顯.

注：A為對照組，B為INH組，C為槲皮素低劑量組，D為槲皮素高劑量組.下同.

圖4 L-02細胞凋亡率

2.3 槲皮素和INH對細胞Caspase 3活性的影響

由圖5可見：L-02細胞經(jīng)INH處理后，細胞Caspase 3相對活性明顯升高，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與INH組相比，槲皮素高劑量組細胞Caspase 3相對活性明顯降低(P<0.05)，表明槲皮素可抑制細胞Caspase 3相對活性.

圖5 L-02細胞Caspase 3活性Fig.5 Activity of Caspase 3 in L-02 cells

2.4 槲皮素和INH對細胞線粒體ROS水平的影響

由圖6可見：L-02細胞經(jīng)INH處理后，細胞線粒體ROS相對水平明顯升高，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，表明INH可誘導細胞線粒體ROS生成增多；而經(jīng)槲皮素處理后細胞線粒體ROS相對水平明顯低于INH組(P<0.05或P<0.01)，表明槲皮素可抑制細胞線粒體ROS生成，且高劑量組對ROS生成的抑制作用更明顯.

圖6 L-02細胞線粒體ROS水平Fig.6 Level of ROS in mitochondria of L-02 cells

2.5 槲皮素和INH對細胞中p-JNK蛋白表達的影響

JNK是細胞凋亡通路蛋白，因為p-JNK是JNK的活性形式，所以本文研究了細胞中p-JNK蛋白表達情況，結果見圖7和圖8.L-02細胞經(jīng)INH處理后，與對照組相比，細胞中p-JNK蛋白表達明顯增高(P<0.01)，表明INH可誘導L-02細胞中p-JNK蛋白表達；與INH組相比，槲皮素高劑量組細胞中p-JNK蛋白表達明顯降低(P<0.05)，表明槲皮素可抑制L-02細胞中p-JNK蛋白表達.

圖7 L-02細胞中p-JNK蛋白表達條帶Fig.7 Expression bands of p-JNK protein in L-02 cells

圖8 L-02細胞中p-JNK蛋白表達分析Fig.8 Analysis of p-JNK protein expression in L-02 cells

3 討 論

目前，INH誘導肝損傷的機制尚未闡明.研究表明，線粒體是藥物細胞毒性的主要靶點，也是ROS產(chǎn)生的主要場所[14-15].近年來，線粒體在細胞氧化損傷和凋亡機制研究中的作用越來越受到學者們的關注[16].槲皮素是黃酮類化合物，具有良好的保肝作用[17].研究表明，槲皮素在體外可通過清除氧自由基、抗氧化、抗凋亡等發(fā)揮作用[19].前期研究發(fā)現(xiàn)，INH在體內和體外均可誘導肝細胞氧化損傷，產(chǎn)生大量的ROS，而槲皮素對其具有保護作用，但其作用機制尚不清楚[10-12,19].目前認為ROS介導JNK通路是JNK通路的重要成員之一，ROS/JNK通路在細胞分化、氧化應激反應、細胞凋亡的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[13].本實驗主要研究了INH對L-02細胞凋亡的影響，并重點探討了ROS/JNK通路在槲皮素抑制INH誘導L-02細胞凋亡中的作用.

本研究檢測了L-02細胞存活率、LDH活性、細胞凋亡率及Caspase 3活性.LDH釋放或漏出是反映細胞膜受損的重要指標，LDH漏出量的多少可間接反映細胞受損程度[20]，而Caspase 3是細胞凋亡過程中的一個關鍵酶，Caspase 3的活化可啟動細胞線粒體凋亡途徑.本研究結果顯示，L-02細胞經(jīng)INH處理后，細胞存活率明顯降低，LDH漏出和細胞凋亡率明顯增加，且Caspase 3活性明顯增高，表明INH對L-02細胞具有毒性作用，能夠造成細胞膜損傷，激活Caspase 3蛋白酶，啟動細胞線粒體凋亡途徑，誘導細胞凋亡.Cristina等研究也發(fā)現(xiàn)，INH能誘導肝細胞發(fā)生氧化損傷，從而導致細胞凋亡[21].本文的研究結果與此相似. 本研究還發(fā)現(xiàn)，采用槲皮素處理L-02細胞能增加細胞存活率，減少LDH漏出和細胞凋亡率，并能夠降低Caspase 3活性，表明槲皮素對INH誘導的L-02細胞損傷及凋亡具有保護效應.這與文獻[22]的研究結果一致.

為探究INH誘導L-02細胞凋亡是否與ROS及JNK有關，本研究進一步檢測了細胞線粒體ROS水平及細胞中JNK蛋白表達情況.ROS是細胞內主要的氧自由基，它的水平能反映細胞內氧化系統(tǒng)的情況，同時ROS具有很高的生物學活性，可作為第二信使參與到JNK通路中.ROS是JNK上游信號分子，ROS可促進JNK活化，而活化的JNK反過來刺激產(chǎn)生更多的ROS，最終JNK被持續(xù)活化，活化的JNK可啟動Caspase級聯(lián)反應，促進細胞凋亡；而阻止JNK的活化可抑制細胞凋亡[23].本研究發(fā)現(xiàn)，L-02細胞經(jīng)INH處理后，細胞線粒體ROS生成和JNK蛋白表達增多，而槲皮素能明顯減少細胞線粒體ROS生成，并抑制細胞JNK蛋白表達.這表明INH可能是通過增加ROS的生成激活JNK通路，啟動Caspase級聯(lián)反應，從而誘導細胞凋亡；槲皮素可能是通過減少ROS的生成抑制JNK通路，降低Caspase 3酶活性，從而抑制細胞凋亡.

綜上，在本文的研究條件下，INH可誘導L-02細胞發(fā)生凋亡，槲皮素對INH誘導的肝細胞凋亡具有保護作用，其機制可能與其抑制ROS/JNK通路有關，但具體的作用機制還有待深入研究.