酵母富硒蛋白提取條件優(yōu)化

鄧乾坤，紀(jì)彥宇，蔣 霞，王 斌，史學(xué)偉*

（石河子大學(xué) 食品學(xué)院，新疆 石河子 832000）

硒是第六主族元素，以有機(jī)硒[1]和無(wú)機(jī)硒[2]兩種形式存在于自然界中。無(wú)機(jī)硒主要有單質(zhì)硒、硒化物、硒酸鹽等，具有較強(qiáng)的毒性[3]；有機(jī)硒主要包括硒代半胱氨酸、硒蛋氨酸、硒蛋白等，低毒或無(wú)毒[4]。硒是人體必需的微量元素，具有提高機(jī)體免疫力、抗衰老、防癌抗癌、調(diào)節(jié)維生素的吸收與消耗等功能[5]。硒缺乏嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致心臟病、肌肉萎縮和人體機(jī)能的紊亂，克山病及大骨節(jié)病就是硒元素?cái)z入不足時(shí)引起的疾病[6]。然而，攝入過(guò)多硒元素也會(huì)危害人體健康，世界衛(wèi)生組織（world health organization，WHO）推薦健康成年人硒日攝入量為50 μg[7]。最傳統(tǒng)的補(bǔ)硒方式是將無(wú)機(jī)硒物質(zhì)—亞硒酸鈉作為硒源[8]。然而，亞硒酸鈉具有毒性作用和腐蝕性作用，添加的劑量過(guò)多時(shí)會(huì)危害人體健康發(fā)生中毒現(xiàn)象。有機(jī)硒具有很強(qiáng)的生物活性，對(duì)人體的毒性作用較低，人體吸收利用率高[9]。用有機(jī)硒強(qiáng)化硒元素是功能性食品的研究熱點(diǎn)之一，具有廣泛的市場(chǎng)前景，如富硒茶葉[10]、富硒大蒜[11]、富硒水稻[12]、富硒食用菌[13]和富硒酵母[14]等。

富硒酵母是將酵母放入含有無(wú)機(jī)硒（亞硒酸鈉）的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中一定數(shù)量的無(wú)機(jī)硒能被酵母同化為有機(jī)硒而變成富硒酵母[15]。富硒酵母具有富硒能力高、發(fā)酵條件簡(jiǎn)單、周期短、產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)，補(bǔ)硒價(jià)值極高[16]。釀酒酵母和產(chǎn)朊假絲酵母因具有較高富硒能力，常被用作有機(jī)硒載體[17]。在富硒酵母的細(xì)胞膜上會(huì)存在許多有機(jī)硒，大部分物質(zhì)的存在形式為硒代半胱氨酸，少部分物質(zhì)為硒代蛋氨酸和非氨基形式的有機(jī)硒化合物[18]。富硒酵母自身富含豐富的蛋白質(zhì)、糖類和B族維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在作為補(bǔ)硒的有機(jī)硒源之外，還可以提供其他的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。富硒酵母可以作為安全的食品添加劑進(jìn)行食用[19]，它對(duì)人體的毒性作用與無(wú)機(jī)硒相比危害小，副作用低[20]。尤其是在生物轉(zhuǎn)化率方面，富硒酵母細(xì)胞可以將硒通過(guò)生物代謝作用進(jìn)行轉(zhuǎn)化，且高于無(wú)機(jī)硒的轉(zhuǎn)化效率，可以作為一種天然的生物制劑品進(jìn)行開(kāi)發(fā)[21]，食用富硒酵母產(chǎn)品與服用含有亞硒酸鈉的無(wú)機(jī)硒產(chǎn)品相比，前者更具有安全有效的優(yōu)點(diǎn)，提高人體身體健康。綜合來(lái)看，把含有富硒酵母的產(chǎn)品作為一種良好的硒源來(lái)取代亞硒酸鈉等無(wú)機(jī)硒產(chǎn)品，可以提高人體補(bǔ)硒的安全性，并且將危害風(fēng)險(xiǎn)降到最低水平。

有機(jī)硒是由富硒酵母細(xì)胞把無(wú)機(jī)硒通過(guò)生物作用轉(zhuǎn)化到細(xì)胞內(nèi)部的蛋白質(zhì)以及多糖上面[22]。由于有機(jī)硒具有毒性小，人體吸收率高的優(yōu)勢(shì)，在食品應(yīng)用方面可開(kāi)發(fā)為功能性食品添加劑。富硒酵母硒蛋白作為一種安全、有效的高富硒來(lái)源，在未來(lái)的市場(chǎng)上有著廣闊的應(yīng)用前景[23]。本研究以實(shí)驗(yàn)室前期分離的高富硒酵母XJ1-3為原料，通過(guò)單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化酵母富硒蛋白提取條件，以期為酵母富硒蛋白在食品發(fā)酵工業(yè)應(yīng)用提供基礎(chǔ)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

富硒酵母菌株：庫(kù)德里阿茲威氏畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）XJ1-3，由本實(shí)驗(yàn)室篩選和保藏在-80 ℃的超低溫冰箱中。

發(fā)酵液培養(yǎng)基：葡萄糖25 g，蛋白胨25 g，酵母浸粉8 g，亞硒酸鈉30 mg，水1 000 mL，pH6.0，121 ℃滅菌20 min。

體積分?jǐn)?shù)90%乙醇、硫酸鈉、氫氧化鈉、氯化鈉、碳酸氫鈉（均為分析純）：北京奧博星生物技術(shù)公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；BS 2000S 型電子天平：上海西唐生物科技有限公司；DW-86L158-80 ℃超低溫冰箱：山東艾普儀器設(shè)備有限公司；B250電熱恒溫水浴鍋：上海予卓?jī)x器有限公司；SW-CJ-2D無(wú)菌操作臺(tái)：蘇潔凈化設(shè)備有限公司；SPX-250B生化培養(yǎng)箱：常州諾基儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母富硒蛋白的提取工藝

富硒酵母擴(kuò)培：用滅菌環(huán)從斜面培養(yǎng)基中挑取富硒酵母接入15 mL試管（裝有9 mL發(fā)酵液培養(yǎng)基），30 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)23 h，按10%接種量接種富硒酵母擴(kuò)培液于250 mL發(fā)酵瓶中，根據(jù)測(cè)得的生長(zhǎng)曲線確定富硒蛋白的提取時(shí)間。

發(fā)酵：將保存的富硒酵母菌株活化后接種于發(fā)酵液培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)24 h。

酵母富硒蛋白提?。号囵B(yǎng)24 h的發(fā)酵液培養(yǎng)基在4 ℃條件下，8 000 r/min離心15 min，用去離子水反復(fù)洗滌沉淀3次，傾去上清液，冷凍干燥獲得備用的富硒酵母干粉[24]。稱取上述富硒酵母干粉樣品1 g置于容器中，用0.10 mol/L NaOH溶液，按8∶1（mL∶g）的液料比于37 ℃條件下水浴振蕩提取120 min，然后放入180 r/min搖床中37 ℃保溫2 h，浸提液在4 ℃條件下8 000 r/min離心15 min，分離除去沉淀，保留上清液。

純化：在上清液中加入飽和度為50%的硫酸銨，于磁力攪拌器上勻速攪拌3 h，4 ℃沉淀過(guò)夜。將得到的上清液在4 ℃條件下，8 000 r/min離心15 min[25]。向得到的富硒蛋白沉淀中加入適量超純水在磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）中透析除鹽，經(jīng)Sephadex G-75層析柱分離純化得到酵母富硒蛋白，以酵母富硒蛋白的提取率為最終指標(biāo)。

1.3.2 酵母富硒蛋白提取條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

保持其他條件不變，只改變其中一個(gè)因素，分別考察NaOH濃度（0.05 mol/L、0.10 mol/L、0.15 mol/L、0.20 mol/L、0.25 mol/L），液料比（5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1（mL∶g））、提取時(shí)間（30 min、60 min、90 min、120 min、150 min）對(duì)酵母富硒蛋白提取的影響，以酵母富硒蛋白的提取率為最終指標(biāo)。

1.3.3 酵母富硒蛋白提取條件優(yōu)化響應(yīng)面分析試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以NaOH濃度（A）、液料比（B）和提取時(shí)間（C）為3個(gè)評(píng)價(jià)因素，以酵母富硒蛋白提取率（Y）為響應(yīng)值，采用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)酵母富硒蛋白提取條件進(jìn)行優(yōu)化[26]。響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 酵母富硒蛋白提取條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for extraction conditions optimization of yeast selenium-enriched protein

1.3.4 測(cè)定方法

富硒蛋白含量的測(cè)定：采用考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定富硒蛋白，以牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制牛血清蛋白質(zhì)溶液濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線[27]。得到牛血清蛋白溶液濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=5.231 43X+0.008 43，利用該回歸方程計(jì)算富硒蛋白含量。

富硒蛋白提取率的計(jì)算方法：

式中：m1為浸取液中蛋白質(zhì)的質(zhì)量，g；m2為富硒酵母干粉的質(zhì)量，g。

硒含量的測(cè)定：酵母富硒蛋白中硒含量的測(cè)定采用催化分光光度法，以硒含量作為橫坐標(biāo)，吸光度值作為縱坐標(biāo)，繪制硒的標(biāo)準(zhǔn)曲線[28]。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert 8.0.6.1軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)，運(yùn)用該軟件的數(shù)據(jù)分析功能進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，建立回歸模型，并對(duì)建立的模型進(jìn)行驗(yàn)證，利用Origin 8.5和SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母富硒蛋白提取條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.1.1 NaOH濃度對(duì)酵母富硒蛋白提取的影響

NaOH濃度對(duì)酵母富硒蛋白提取的影響見(jiàn)圖1。

由圖1可知，酵母富硒蛋白提取率隨NaOH濃度的增大呈先增大后減小的趨勢(shì)。當(dāng)NaOH濃度由0.05 mol/L增加至0.10 mol/L時(shí)，酵母富硒蛋白提取率呈上升趨勢(shì)。NaOH濃度達(dá)到0.10 mol/L時(shí)，酵母富硒蛋白的提取率最大，為12.5%。NaOH濃度超過(guò)0.10 mol/L后，酵母富硒蛋白的提取率呈下降趨勢(shì)。推測(cè)可能是過(guò)高濃度的NaOH溶液會(huì)使部分蛋白質(zhì)發(fā)生變性。因此選擇NaOH濃度為0.05 mol/L、0.10 mol/L、0.15 mol/L進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 NaOH濃度對(duì)酵母富硒蛋白提取率的影響Fig.1 Effect of NaOH concentration on extraction rate of yeast selenium-enriched protein

2.1.2 液料比對(duì)酵母富硒蛋白提取的影響

液料比對(duì)酵母富硒蛋白提取的影響見(jiàn)圖2。

圖2 液料比對(duì)酵母富硒蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of liquid and material ratio on extraction rate of yeast selenium-enriched protein

由圖2可知，酵母富硒蛋白提取率隨液料比的增大呈先增后減的趨勢(shì)。當(dāng)液料比由5∶1增加至8∶1時(shí)，酵母富硒蛋白提取率呈上升趨勢(shì)。液料比為8∶1時(shí)，酵母富硒蛋白的提取率最大，為12.5%。液料比超過(guò)8∶1時(shí)，酵母富硒蛋白的提取率呈下降趨勢(shì)。推測(cè)發(fā)生這種現(xiàn)象的主要原因是，氫氧化鈉溶液與冷凍干燥后的富硒酵母粉末接觸不完全，細(xì)胞里面的富硒蛋白還無(wú)法全部溶解出來(lái)。因此選擇料液比值7∶1、8∶1、9∶1進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)酵母富硒蛋白提取的影響

提取時(shí)間對(duì)酵母富硒蛋白提取的影響見(jiàn)圖3。

由圖3可知，酵母富硒蛋白提取率隨提取時(shí)間的增加呈先增大后減小的趨勢(shì)。當(dāng)提取時(shí)間由30 min增加至120 min時(shí)，酵母富硒蛋白提取率呈上升趨勢(shì)。提取時(shí)間為120 min時(shí)，酵母富硒蛋白的提取率最大，為12.21%。提取時(shí)間超過(guò)120 min時(shí)，酵母富硒蛋白的提取率呈下降趨勢(shì)。推測(cè)發(fā)生這種現(xiàn)象的主要原因是，由于提取的時(shí)間過(guò)短氫氧化鈉溶液的濃度與富硒蛋白結(jié)合不完全，導(dǎo)致富硒蛋白不能夠全部溶解出來(lái)，產(chǎn)生富硒蛋白提取率低的情況。因此選擇提取時(shí)間為90 min、120 min、150 min 進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖3 提取時(shí)間對(duì)酵母富硒蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on extraction rate of yeast selenium-enriched protein

2.2 酵母富硒蛋白提取條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

酵母富硒蛋白提取條件優(yōu)化響應(yīng)面分析試驗(yàn)結(jié)果與分析見(jiàn)表2，回歸模型的方差分析見(jiàn)表3。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface methodology

表3 回歸模型的回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)與方差分析Table 3 Significant tests and variance analysis of regression coefficient of regression model

對(duì)表3的數(shù)據(jù)用Design Expert軟件進(jìn)行分析，進(jìn)行三元二次回歸方程擬合，獲得的響應(yīng)值為酵母富硒蛋白的提取率對(duì)編碼自變量的二次項(xiàng)回歸方程：

由回歸模型方差分析結(jié)果（表3）可以看出，模型P＜0.000 1說(shuō)明試驗(yàn)所選用的二次多項(xiàng)模型極顯著。一次項(xiàng)A、C，二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)酵母富硒蛋白提取率的影響極顯著（P＜0.01），交互項(xiàng)AC對(duì)酵母富硒蛋白提取率的影響顯著（P＜0.05）。影響酵母富硒蛋白提取率的主次因素依次為A＞C＞B，即NaOH濃度＞提取時(shí)間＞液料比。失擬項(xiàng)P=0.201 3＞0.05不顯著，表明所建立的回歸二次模型成立，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.947 3，表明可用此模型這說(shuō)明該模型解釋酵母富硒蛋白提取提取率有94.73%，具有可靠性，富硒蛋白的提取率變化可由虛擬模型解釋。決定系數(shù)R2為0.977 0，這個(gè)數(shù)據(jù)表明響應(yīng)值的實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值之間具有非常高的相關(guān)性。通過(guò)這個(gè)方差顯著性分析數(shù)據(jù)能夠說(shuō)明Design-Expert 8.0.6軟件建立的這個(gè)模型能夠通過(guò)擬合值來(lái)代表真實(shí)值，響應(yīng)面法的最終預(yù)測(cè)出的酵母富硒蛋白提取工藝與真實(shí)的提取工藝相近，這種預(yù)測(cè)方法具有代表性。

由圖4可知，在液料比為8∶1（mL∶g）時(shí)，NaOH濃度不變，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，富硒蛋白提取率逐漸增加達(dá)到最大值。提取時(shí)間一定時(shí)，持續(xù)增加NaOH濃度，富硒蛋白提取率逐漸增加達(dá)到最大值。NaOH濃度與提取時(shí)間的交互作用影響顯著，與方差分析顯著性結(jié)果相一致。

圖4 NaOH濃度與提取時(shí)間交互作用對(duì)酵母富硒蛋白提取率影響的響應(yīng)曲面及等高線Fig.4 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between NaOH concentration and extraction time on the extraction rate of yeast selenium-enriched protein

酵母富硒蛋白最佳提取工藝參數(shù)為NaOH濃度0.11mol/L、液料比為7.51∶1（mL∶g）、提取時(shí)間139.81 min。在此條件下，酵母富硒蛋白提取率理論值為12.62%。為方便實(shí)際操作，將提取工藝參數(shù)修正為NaOH濃度0.1 mol/L、液料比為7.5∶1（mL∶g）、提取時(shí)間140 min。在此條件下，實(shí)際測(cè)得的酵母富硒蛋白平均提取率實(shí)際值為12.58%，酵母富硒蛋白中硒含量為358.9 μg/g。與預(yù)測(cè)出來(lái)的理論值相接近，進(jìn)一步驗(yàn)證了模擬出來(lái)的數(shù)學(xué)回歸模型的準(zhǔn)確性，得到的工藝參數(shù)與試驗(yàn)所得的數(shù)值相差不大。

3 結(jié)論

采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，建立酵母富硒蛋白提取工藝參數(shù)的二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型，經(jīng)檢驗(yàn)該模型是合理可靠的，可以合理的預(yù)測(cè)提取酵母富硒蛋白的產(chǎn)率。提取富硒蛋白工藝參數(shù)對(duì)富硒蛋白的提取率有顯著影響，影響因子的主要順序?yàn)镹aOH濃度＞提取時(shí)間＞液料比。酵母富硒蛋白提取優(yōu)化工藝的參數(shù)為NaOH 0.1 mol/L、液料比為7.5∶1（mL∶g）、提取時(shí)間140 min，酵母富硒蛋白的提取率可達(dá)12.58%，酵母富硒蛋白中硒含量為358.9 μg/g。通過(guò)這種工藝技術(shù)，為以后富硒產(chǎn)品在食品添加劑，食品發(fā)酵等產(chǎn)業(yè)中提供一定的理論基礎(chǔ)。