5種漿果果酒抗氧化活性差異及綜合評價

許立偉，王炳宇，楊馨悅，薛桂新*

（延邊大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002）

藍莓（Blueberry）不僅含有脂肪、蛋白質(zhì)、維生素和大量的微量元素[1-2]，還富含花青素[3]、糖苷、黃醇酮等活性成分[4]，具有防止腦神經(jīng)老化、抗癌、軟化血管、增強機體自身免疫、清除自由基和體內(nèi)有害物質(zhì)等功能[5-6]。藍靛果學(xué)名為藍靛果忍冬（Lonicera caeruleaL.），富含花色苷、藍靛果多糖等成分[7]，具有抗腫瘤、抗氧化[8]、降低膽固醇含量、促進血液循環(huán)等功效[9]。不老莓學(xué)名為黑果腺肋花楸（Aronia melanocarpa（Michx.）Ell.），富含花青素、黃酮等多酚類物質(zhì)[10]，具有一定的清除自由基能力[11]、對預(yù)防癌癥、心血管疾病、慢性炎癥等有一定的作用[12-13]。研究表明，將果實加工成果酒有利于保持原果實中的營養(yǎng)成分及功效活性[14]。

目前已有學(xué)者對藍莓果酒、藍靛果、黑果腺肋花楸果酒分別進行了營養(yǎng)成分和抗氧化活性的研究，陳亮等[15]研究了發(fā)酵期間藍莓果酒總酚含量、花色苷含量、自由基清除率以及還原力的變化并對其進行相關(guān)性分析。梁慧等[16]發(fā)現(xiàn)隨著發(fā)酵時間的延長，藍莓果酒的抗氧化能力逐漸減小。薛桂新[17]對陳釀期間不同藍莓添加量的藍靛果復(fù)合果酒的抗氧化能力的變化趨勢進行了研究，發(fā)現(xiàn)其抗氧化活性有所差異，且隨著陳釀時間的延長藍靛果藍莓復(fù)合果酒抗氧化能力下降。魏春雨等[18]研究了不同釀酒酵母對黑果腺肋花楸果酒成分的影響，結(jié)果表明，不同酵母菌發(fā)酵的黑果腺肋花楸果酒中香氣物質(zhì)含量有所差異。然而鮮有關(guān)于這3種果酒在營養(yǎng)成分及抗氧化活性方面的差異性的研究報道。

本研究選用藍莓、藍靛果及不老莓發(fā)酵釀制成果酒，測定其理化指標(biāo)、單體酚類物質(zhì)含量、對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、羥基自由基（·OH）、2,2-連氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS）自由基、超氧陰離子自由基（O2-·）的清除率，探究5種漿果果酒抗氧化活性的差異，并通過主成分分析（principal component analysis，PCA）對其進行綜合評價。以期為藍莓、藍靛果、不老莓果酒的加工和開發(fā)提供技術(shù)依據(jù)，為更好地利用長白山地區(qū)漿果資源提供技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌株

野生藍莓（blueberry）、栽培藍莓（北陸）：長白山地區(qū)安圖縣；野生藍靛果（Lonicera caeruleaL.）、栽培藍靛果（蓓蕾）和不老莓（Aronia melanocarpa（Michx.）Ell.）：長白山地區(qū)汪清縣；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：意大利AEB公司。

1.1.2 試劑

維生素C、DPPH、無水乙醇、ABTS、過硫酸鉀、硫酸亞鐵、水楊酸、過氧化氫、鄰苯三酚、三羥甲基氨基甲烷（Tris（hydroxymethyl）aminomethane，THAM）、鹽酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸（tri-chloroaceticacid，TCA）、氯化鐵、苯酚、濃硫酸、福林試劑、無水碳酸鈉（均為分析純）：天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；沒食子酸、（+）-兒茶素、綠原酸、咖啡酸、表兒茶素、對香豆酸、阿魏酸、蘆丁、白藜蘆醇、槲皮素、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品（純度均＞98%）：上海源葉生物科技有限公司；果膠酶（酶活30 000 U/g）：和氏璧生物科技有限公司；纖維素酶（酶活10 000 U/g）：南寧東恒華道生物科技有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BSA124S-CW電子分析天平：北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；TDZ5-WS高速離心機：湖南湘儀實驗儀器有限公司；WY-055型手持糖度儀：長春市第四光學(xué)儀器廠；PHS-3C型酸度計：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；UV1101紫外分光光度計：上海新茂儀器有限公司；LC-2010A高效液相色譜儀：日本島津公司；C18Elipse Plus色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）：美國安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 漿果果酒工藝操作要點

操作要點：

漿果預(yù)處理、破碎打漿：選無腐爛、成熟度一致的果實，將果實破碎。

酶解、調(diào)整糖度：加入0.05%的果膠酶與0.1%纖維素酶在溫度25 ℃時酶解2 h，加入白砂糖，調(diào)整果漿糖度至21.5～22°Bx。

活化酵母：取果實質(zhì)量0.02%的果酒釀酒酵母，按1∶20的比例加入38 ℃的溫水，放入38 ℃恒溫水浴鍋中活化30 min。

主發(fā)酵：在25 ℃左右室溫發(fā)酵7～10 d，當(dāng)酒精度為12%vol左右時，發(fā)酵結(jié)束，采用40目濾酒器過濾。

后發(fā)酵：將果酒酒液在室溫（25 ℃）發(fā)酵1個月。

常溫貯存：后發(fā)酵結(jié)束后在室溫（20～25 ℃）貯藏3個月即得漿果果酒，備用。

1.3.2 理化指標(biāo)的測定

取2.0 mL果酒，用蒸餾水稀釋配制40 μL/mL的果酒稀釋液50 mL，穩(wěn)定后放置，用于理化指標(biāo)的測定，操作全程避光。

總糖含量的測定：參考劉志明等[19]的苯酚-硫酸法。

總酸含量的測定：參考楊宇馳等[20]的方法。

多酚含量的測定：采用Folin-Ciocalteu法[21]，以沒食子酸作為標(biāo)準(zhǔn)品進行定量。

總黃酮含量的測定：參考鄭嬌等[22]的方法，以蘆丁作為標(biāo)準(zhǔn)品進行定量。

總花色苷含量的測定：參考李安等[23]的方法。

1.3.3 單體酚類物質(zhì)含量的測定

單體酚類物質(zhì)含量的測定參照孫翔宇等[24]的方法，方法略有改動。取漿果果酒樣品25 mL于3 000 r/min離心10 min后，取上清液10 mL，以2倍體積的乙酸乙酯萃取3次，合并有機相，35 ℃條件下減壓濃縮至干，以5 mL甲醇復(fù)溶，過0.22 μm濾膜后進樣分析。

色譜條件：采用C18Elipse Plus色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），配備紫外（ultra violet，UV）檢測器。采用二元梯度洗脫：流動相A為乙腈-冰乙酸（98∶2，V/V），流動相B為水-冰乙酸（98∶2，V/V）。洗脫程序為：0～60 min，A流動相5%～15%；60～65 min，A流動相15%；65～66 min，A流動相15%～20%；66～73 min，A流動相20%；73～74 min，A流動相20%～30%；74～80 min，A流動相30%；80～81 min，A流動相30%～40%；81～93 min，A流動相40%；93～98 min，A流動相40%～5%；98～103 min，A流動相5%。柱溫：30 ℃，流速：0.8 mL/min，進樣量：20 μL。

定性定量分析：根據(jù)各標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時間定性，根據(jù)外標(biāo)法定量。

1.3.4 抗氧化活性的測定

DPPH·清除率：參考MAU J L等[25]的方法進行測定。

ABTS+·清除率：參考LIU X Y等[26]的方法進行測定。

·OH清除率：參照程宏楨等[27]的方法并改動，改動如下：考慮到提取物本身具有顏色會產(chǎn)生一定的吸光度值，因此，以樣品水提液1mL、10mmol/LFeSO41mL和10 mmol/L水楊酸-乙醇溶液1 mL 和1 mL蒸餾水測定的吸光度值作為本底值。

O2-·清除率：參照呂聞明[28]的方法并改動，改動如下：取樣品水提液0.2 mL，加入50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液（pH8.2）5.6 mL，在25 ℃水浴中混合反應(yīng)20 min，立即加入3 mmol/L鄰苯三酚溶液0.2 mL。

還原力：參照烏日娜等[29]的方法進行測定。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

運用SPSS 25.0軟件對結(jié)果進行顯著性分析，對5種漿果果酒的抗氧化活性指標(biāo)進行主成分分析，根據(jù)各主成分因子得分系數(shù)和方差貢獻率計算綜合得分[30]。

2 結(jié)果與分析

2.1 5種漿果果酒的理化指標(biāo)對比

5種漿果果酒的理化指標(biāo)測定結(jié)果見表1。

表1 5種漿果果酒的理化指標(biāo)Table 1 Physical and chemical indexes of 5 kinds of berry wines

由表1可知，兩種藍莓果酒、兩種藍靛果果酒之間總糖含量不存在顯著性差異（P＞0.05），不老莓果酒總糖含量只與野生藍靛果果酒存在顯著性差異（P＜0.05），與其他樣品均不存在顯著性差異（P＞0.05）；5種漿果果酒的總酸、多酚、總黃酮、總花色苷含量均存在顯著性差異（P＜0.05）。其中野生藍靛果果酒的總糖、總酸、多酚、總黃酮、總花色苷含量最高，分別為1.55%、3.82%、9.69 mg/g、12.58 mg/g、1.21 mg/g，北陸藍莓果酒的總糖、總酸、多酚及總黃酮含量最低，分別為0.51%、0.99%、1.09 mg/g、2.38 mg/g、0.01 mg/g，不老莓果酒的總花色苷含量最低（0.01 mg/g）。

2.2 5種漿果果酒的單體酚類物質(zhì)含量對比

由表2可知，5種漿果果酒中野生藍靛果果酒的咖啡酸、兒茶素、表兒茶素、綠原酸、對香豆酸、蘆丁含量最高，分別為66.19 mg/g、878.09 mg/g、13.28 mg/g、735.50 mg/g、275.32mg/g、23.86mg/g，顯著高于其他果酒（P＜0.05）；野生藍莓果酒沒食子酸、阿魏酸、白藜蘆醇含量分別為21.94 mg/g、7.52 mg/g、52.68 mg/g，顯著高于其他果酒（P＜0.05）。5種漿果果酒10種單體酚類物質(zhì)中兒茶素和綠原酸含量明顯高于單體酚類物質(zhì)中其他物質(zhì)（P＜0.05），且野生果實發(fā)酵的果酒單體酚類物質(zhì)含量均高于人工種植果實發(fā)酵的果酒。在相同發(fā)酵條件下，5種果酒的化合物含量變化趨勢一致。因此，造成單體酚類物質(zhì)中各成分含量有差異的原因在于果實本身所含成分。而野生果實發(fā)酵的果酒中單體酚類物質(zhì)各成分含量高于人工種植果實發(fā)酵的果酒的原因可能與生長條件（土壤、光照等）有關(guān)，且在人工育種時，主要考慮人們對果實喜好的口感，導(dǎo)致一定的單體酚類物質(zhì)成分損失。因此，綜合考慮，野生藍靛果果酒所含單體酚類物質(zhì)含量更高。

表2 5種漿果果酒單體酚類物質(zhì)含量Table 2 Contents of monomer phenols in 5 kinds of berry wines

2.3 5種漿果果酒的抗氧化活性對比

2.3.1 5種漿果果酒的DPPH·清除率

5種漿果果酒的DPPH·清除率見圖1。

圖1 5種漿果果酒DPPH·清除率的比較Fig.1 Comparison of DPPH·scavenging rate of 5 kinds of berry wines

由圖1可知，5種漿果果酒DPPH·清除率均存在顯著性差異（P＜0.05），按照DPPH·清除率的高低對不同果酒排序為：野生藍靛果果酒（92.29%）＞蓓蕾藍靛果果酒（81.64%）＞野生藍莓果酒（64.80%）＞不老莓果酒（44.36%）＞北陸藍莓果酒（20.51%）。這與漿果果酒多酚含量的結(jié)果一致。由于漿果果酒中含有多酚和黃酮類的抗氧化活性成分，對DPPH·具有一定的清除率，且多酚、黃酮含量高的漿果果酒對DPPH·清除率高[31]。因此，野生藍靛果果酒的DPPH·清除率最好。

2.3.2 5種漿果果酒的ABTS+·清除率

5種漿果果酒的ABTS+·清除率見圖2。

圖2 5種漿果果酒ABTS+·清除率的比較Fig.2 Comparison of ABTS+·scavenging rate of 5 kinds of berry wines

由圖2可知，野生藍靛果果酒（96.13%）與野生藍莓果果酒（96.77%）、不老莓果酒（96.05%）的ABTS+·清除率不存在顯著性差異（P＞0.05），均與其他果酒存在顯著性差異（P＜0.05），按照ABTS+·清除率的高低對不同果酒排序為：野生藍莓果酒（96.77%）＞野生藍靛果果酒（96.13%）＞蓓蕾藍靛果果酒（94.89%）＞不老莓果酒（96.05%）＞北陸藍莓果酒（84.63%）。有研究表明，酚類物質(zhì)與抗氧化活性呈正相關(guān)[32]，由于漿果果酒中含有總花色苷以及豐富的酚類化合物，對果酒的ABTS+·清除率影響呈正相關(guān)。因此，野生藍靛果果酒、野生藍莓果果酒和不老莓果酒的ABTS+·的清除率最好。

2.3.3 5種漿果果酒的·OH清除率

5種漿果果酒對·OH清除率見圖3。

圖3 5種漿果果酒·OH清除率的比較Fig.3 Comparison of·OH scavenging rate of 5 kinds of berry wines

由圖3可知，野生藍靛果果酒的·OH清除率最好，與其他果酒存在顯著差異（P＜0.05）。野生藍莓果酒和蓓蕾藍靛果果酒·OH清除率不存在顯著性差異（P＞0.05），但與其他果酒存在顯著性差異（P＜0.05）。按照·OH清除率的高低對不同果酒排序為：野生藍靛果果酒（96.28%）＞蓓蕾藍靛果果酒（94.11%）＞野生藍莓果酒（93.39%）＞北陸藍莓果酒（39.98%）＞不老莓果酒（20.42%）。野生藍靛果果酒、野生藍莓果酒、蓓蕾藍靛果果酒的·OH清除率顯著高于北陸藍莓果酒和不老莓果酒。有研究表明，酚羥基可以與自由基反應(yīng)生成較穩(wěn)定的半羥基自由基，而漿果果酒中含有豐富的酚類物質(zhì)，對·OH有一定的清除能力[33]。因此，野生藍靛果果酒的·OH清除率最好。

2.3.4 5種漿果果酒的O2-·清除率

5種漿果果酒的O2-·清除率見圖4。由圖4可知，5種漿果果酒中野生藍莓果酒的O2-·清除率最強，野生藍靛果果酒與不老莓果酒的O2-·清除率不存在顯著性差異（P＞0.05），但與其他三種果酒均存在顯著性差異（P＜0.05）。按照O2-·清除率的高低對果酒進行排序為：野生藍莓果酒（50.54%）＞不老莓果酒（33.45%）＞野生藍靛果果酒（33.27%）＞北陸藍莓果酒（32.19%）＞蓓蕾藍靛果果酒（25.18%）。漿果果酒中多酚類物質(zhì)含量豐富，多酚是多羥基酚類衍生物的混合物，多以結(jié)合酚形式存在，黃酮類化合物具有共軛雙鍵結(jié)構(gòu)，其易發(fā)生聚合、縮合、水解及氧化反應(yīng)等，對O2-·有一定的清除能力[34]。因此，野生藍莓果酒的O2-·清除率最好。

圖4 5種漿果果酒O2-·清除率的比較Fig.4 Comparison of O2-·scavenging rate of 5 kinds of berry wines

2.3.5 5種漿果果酒的還原力

5種漿果果酒的還原力見圖5。由圖5可知，5種漿果果酒還原力均存在顯著性差異（P＜0.05），按照還原力大小對不同果酒進行排序為：野生藍靛果酒（1.744）＞蓓蕾藍靛果酒（0.975）＞野生藍莓果酒（0.817）＞不老莓果酒（0.469）＞北陸藍莓果酒（0.198），這與DPPH·清除率的趨勢一致。

圖5 5種漿果果酒的還原力的比較Fig.5 Comparison of the reducing power of 5 kinds of berry wines

對圖1～圖5進行綜合分析，5種漿果果酒的4種自由基的清除率和還原力表現(xiàn)出的抗氧化活性不同，其中野生藍靛果果酒抗氧化活性較強，北陸藍莓果酒抗氧化活性較弱；野生品種果酒的抗氧化活性顯著高于栽培品種（P＜0.05）。

2.4 5種漿果果酒的抗氧化活性主成分分析

抗氧化活性指標(biāo)主成分分析載荷圖見圖6，特征值與累計貢獻率見表3，載荷矩陣見表4。

表3 漿果果酒抗氧化活性指標(biāo)主成分的特征值與累計貢獻率Table 3 Characteristic value and cumulative contribution rate of the antioxidant activity evaluation factors of berry wines

表4 抗氧化活性指標(biāo)主成分載荷矩陣Table 4 Principal component load factor of antioxidant activity indexes

由圖6可知，DPPH·、ABTS+·、·OH和還原力與O2-·有著明顯的區(qū)分，都存在著正相關(guān)的關(guān)系，這可能是因為漿果果酒中黃酮類化合物易發(fā)生聚合、縮合、水解及氧化反應(yīng)等，對O2-·清除有一定的影響，導(dǎo)致漿果果酒對O2-·的清除能力與其他4種自由基有著一定的區(qū)別，即DPPH·、ABTS+·、·OH和還原力對5種漿果果酒抗氧化活性具有主要貢獻率。

圖6 抗氧化活性指標(biāo)主成分分析載荷圖Fig.6 Main components loading diagram of antioxidant activity of 5 kinds of berry wines

由表3和表4可知，主成分1的特征值為3.190，方差貢獻率為63.81%，主成分2的特征值為1.092，方差貢獻率為21.83%，累計方差貢獻率為85.64%，保留了絕大多數(shù)的原始信息。以2個主成分代表原來5個抗氧化活性指標(biāo)，建立不同樣品抗氧化活性的評價模型，得出以下抗氧化活性指標(biāo)的線性關(guān)系式，

由公式（1）和表4可知，DPPH·、還原力、·OH、ABTS+·對5種漿果果酒抗氧化活性具有主要貢獻率。為能夠反映出5種不同果酒的抗氧化活性差異，以2個主成分的得分及權(quán)重構(gòu)造抗氧化活性指標(biāo)的評價函數(shù)F綜表達式見公式（3），得到的漿果果酒抗氧化活性綜合得分及排名見表5。

表5 5種漿果果酒抗氧化活性綜合得分及排名Table 5 Comprehensive score and rankings of 5 kinds of berry wines

由表5可知，野生藍莓果酒、野生藍靛果果酒和蓓蕾藍靛果果酒綜合得分較高且均為正數(shù)，抗氧化活性較好，分別排名1、2、3，不老莓果酒、北陸藍莓果酒綜合得分為負(fù)，抗氧化活性較低，分別排名4、5。

3 結(jié)論

5種漿果果酒中野生藍靛果果酒的總糖、總酸、多酚、黃酮、花色苷的含量最高，單體酚類物質(zhì)中咖啡酸、兒茶素、表兒茶素、綠原酸、對香豆酸、蘆丁含量最高。野生藍靛果果酒的DPPH·清除率（92.29%）、·OH清除率（96.28%）和還原力（1.744）最強；野生藍莓果酒的ABTS+·清除率（96.77%）和O2-·清除率（50.54%）最強；通過主成分分析建立抗氧化活性指標(biāo)綜合評價模型，計算漿果果酒的綜合得分，對5種漿果果酒的抗氧化活性排序為：野生藍莓果酒＞野生藍靛果果酒＞蓓蕾藍靛果果酒＞不老莓果酒＞北陸藍莓果酒。該研究可為藍莓、藍靛果、不老莓果酒的加工和開發(fā)提供技術(shù)依據(jù)，為更好地利用長白山地區(qū)漿果資源提供技術(shù)指導(dǎo)。