新老窖泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異及其對(duì)釀造白酒質(zhì)量的影響

馮 潛，劉緒興，文 章，陳 杰*

（1.宜賓六尺巷酒業(yè)有限公司，四川 宜賓 644000；2.勁牌有限公司，湖北 黃石 435000）

四川盆地?fù)碛羞m宜釀造的地域性環(huán)境，盛產(chǎn)各型宜人風(fēng)格的濃香型白酒[1]。白酒的主要成分為乙醇和水，含量占據(jù)整個(gè)酒體的98%，余下1%～2%的微量成分，包含呈香呈味的酸類、酯類、醇醛等小分子物質(zhì)，是決定白酒獨(dú)特風(fēng)格與品質(zhì)的骨架成分[2]。濃香型白酒以窖池為其獨(dú)特的發(fā)酵容器，窖池的每輪次發(fā)酵周期在90 d左右。長發(fā)酵期使窖池形成密閉的厭氧環(huán)境，其中棲息的微生物尤其是細(xì)菌類微生物對(duì)白酒骨架香味成分的積累、白酒的風(fēng)格或質(zhì)量的形成具有明顯的決定作用[3]。俗話說“好窖出好酒”，優(yōu)質(zhì)窖泥中的微生物，經(jīng)歷了釀造工藝的長期篩選與馴化，形成了有益于釀造的獨(dú)特群落體系，從而塑造了濃香型白酒以芳香濃郁、綿柔甘洌為主的典型風(fēng)格。窖池微生態(tài)中微生物群落結(jié)構(gòu)及豐度的差異，是不同窖池所釀白酒具有質(zhì)量差異的主要因素[4]。以現(xiàn)代化微生物可培養(yǎng)或非培養(yǎng)[5]的各類技術(shù)實(shí)現(xiàn)窖泥釀造微生態(tài)體系的定向改良，使?jié)庀阈桶拙瓢l(fā)酵質(zhì)量可控，是傳統(tǒng)白酒產(chǎn)業(yè)走向現(xiàn)代化、機(jī)械化、自動(dòng)化的核心問題，前提條件是解剖并認(rèn)識(shí)成熟窖泥的微生物群落結(jié)構(gòu)，辨識(shí)其中的釀造關(guān)鍵微生物并掌握其培養(yǎng)方式[5]。本研究基于高通量測序技術(shù)，比較了新窖泥及成熟窖泥中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性，分析了細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與釀造質(zhì)量的相關(guān)性，為濃香型白酒釀造質(zhì)量的提升提供了參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試窖泥樣品（標(biāo)記為LCX）：來自于宜賓六尺巷酒業(yè)正常發(fā)酵4年且生產(chǎn)的原酒主體香不突出、諸香欠缺協(xié)調(diào)的新窖池；市內(nèi)其他三家酒廠中正常發(fā)酵15年且生產(chǎn)的原酒相對(duì)風(fēng)格典型、諸味協(xié)調(diào)的成熟老窖池，所選窖池執(zhí)行同一套生產(chǎn)工藝，窖期均為90 d，取窖底泥作為樣品，并依次標(biāo)記為YRF、XJF、CXF；以無菌袋裝樣，4 ℃冷凍密封轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室后，立即開展總脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）的提取。

AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒：美國AXYGEN公司；DNA Marker D2000：北京天根生化科技有限公司；帶識(shí)別條碼（barcode）的細(xì)菌16S rRNA基因V3-V4區(qū)擴(kuò)展引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGTWTCTAAT-3'）：北京諾禾致源生物信息科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JXFSTPRP-32全自動(dòng)樣品快速研磨儀：上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；Velocity 18R冷凍高速離心機(jī)：Dynamica Scientific Ltd.；Tarzan 96梯度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：莫納生物科技有限公司；UV 8000紫外可見分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；TanonEPS300凝膠電泳儀、Tanon 2500B凝膠成像系統(tǒng)：上海天能科技有限公司；AC2-6S1生物安全操作柜：新加坡藝思高科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 窖泥總DNA提取及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增

采用十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyltrimethylammonium bromide，CTAB）溶解細(xì)胞膜的方法[6]提取窖泥總DNA。PCR擴(kuò)增體系：TaqMix 10 μL、模版1μL、正反向引物各0.5 μL，使用雙蒸水（ddH2O）補(bǔ)足20 μL；PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性10 min；每個(gè)循環(huán)包含94 ℃變性40 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，一共循環(huán)30次；循環(huán)結(jié)束后，72 ℃延伸10 min。使用2%瓊脂糖凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測。選擇大小在500 bp 左右，符合16S rRNA V3-V4區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物要求的清晰單一條帶，切膠回收。對(duì)符合OD260nm值/OD280nm值=1.8～2.0、OD230nm值/OD260nm值＞2.0條件的高濃度、高純度膠條，送往擎科生物科技有限公司，借助Illumina Miseq平臺(tái)及相關(guān)資源完成高通量測序，并返回原始序列（rawdata）。

1.3.2 生物信息學(xué)分析

為了確保分析數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，利用Mothur軟件[7]對(duì)原始序列進(jìn)行篩選，去掉低質(zhì)量的序列，識(shí)別和消除嵌合體，分類并去除序列首尾兩端的barcode，識(shí)別并剔除單次出現(xiàn)序列（singleton），得到過濾后的高質(zhì)量拼接序列（clean tags）。利用USEARCH軟件[8]依據(jù)序列相似性＞97%的分類要求，將clean tags聚類成為可操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs），并在聚類過程中去除一些測序錯(cuò)誤的序列，提高分析的準(zhǔn)確性。隨后選取每個(gè)OTU中出現(xiàn)頻數(shù)最高的完整序列作為該OTU的代表性序列，用于后續(xù)物種注釋。利用QIIME2軟件[9]中的assign_taxonomy.py腳本將每個(gè)OTU的代表序列與16S rRNA基因擴(kuò)增子注釋數(shù)據(jù)庫Silva比對(duì)，獲得OTUs的物種注釋信息。再使用核糖體數(shù)據(jù)庫項(xiàng)目（ribosomal database project，RDP）Classifier軟件[10]，設(shè)置置信度為0.5以上，校對(duì)并確認(rèn)物種注釋信息的分類學(xué)結(jié)果。分類學(xué)結(jié)果包括界、門、綱、目、科、屬、種7個(gè)層級(jí)。將可注釋的OTUs應(yīng)用于物種多樣性分析，以主成分分析（principal component analysis，PCA）法[11]將樣品的群落差異最大化，找出對(duì)差異的形成具有主要奉獻(xiàn)度且相對(duì)豐度＞0.01%的優(yōu)勢(shì)OTUs。分析過程使用R語言完成作圖[11]。根據(jù)共培養(yǎng)法和非培養(yǎng)法的微生物群落結(jié)構(gòu)中同屬的物種在代謝特征上具有相似性的發(fā)現(xiàn)[4]，使用基本局部搜索工具（basic local alignment tool，BLAST）（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）檢索與優(yōu)勢(shì)OTUs一致性（identity）高且正式發(fā)表的參考物種（reference species），用于系統(tǒng)發(fā)育多樣性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序合理性

高通量測序后，各份樣品獲得的高質(zhì)量clean tags，經(jīng)聚類及與Silva數(shù)據(jù)庫比對(duì)后，獲取到能夠注釋的OTUs總數(shù)見表1。以稀釋性曲線評(píng)估不同樣本的測序合理程度，結(jié)果如圖1所示。由表1、圖1可知，當(dāng)clean tags總數(shù)在10 000以上時(shí)，所有樣本的曲線末端趨向平坦，表明各樣本的測序數(shù)據(jù)量足夠且合理，測序深度足以覆蓋樣品中存在的大多數(shù)微生物。同時(shí)，稀釋性曲線表明，樣品按物種豐富度從大到小排序依次是XJF、YRF、CXF、LCX。

表1 窖泥微生物群落多樣性比較Table 1 Comparison of the diversity of microbial community in pit mud

圖1 窯泥樣品稀釋性曲線Fig.1 Dilution curves of pit mud samples

以等級(jí)豐度曲線評(píng)估樣品的多樣性，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，樣品XJF的曲線在橫軸上的跨度最長最平坦，表明樣品XJF的物種含量相對(duì)最豐富，物種組成相對(duì)最均勻。以alpha多樣性指數(shù)評(píng)估OTUs的多樣性（表1），樣品XJF與YRF的Chao1指數(shù)最大，反映了這兩份樣品擁有比其他樣品更豐富的物種，Chao1指數(shù)結(jié)論與稀釋性曲線結(jié)論一致；樣品XJF的Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)均最大，反映了該份樣品中物種的復(fù)雜度、物種的均勻性與豐度相對(duì)其他樣品高，Simpson指數(shù)的結(jié)論與等極豐度曲線結(jié)論一致。而4份樣品的Chao1、Shannon、Simpson指數(shù)均十分理想，表明高通量測序結(jié)果良好，可用于后續(xù)物種多樣性分析。

圖2 窯泥樣品的等級(jí)豐度曲線Fig.2 Grade abundance curves of pit mud samples

2.2 優(yōu)勢(shì)微生物

以交集方式對(duì)4份樣品的OTUs開展相關(guān)性分析，結(jié)果如圖3所示。

圖3 窖泥樣品的分類操作單元交集Fig.3 Count of intersection of operational taxonomic units from pit mud samples

由圖3可知，4份樣品的共有OTUs數(shù)目為291個(gè)，相對(duì)豐度達(dá)到98.764 3%。任意3份樣品的OTUs相對(duì)豐度的總和為0.731 4%。各份樣品獨(dú)有OTUs數(shù)量少，總豐度只有0.139 1%。經(jīng)過RDP classifier檢校OTUs的分類地位，發(fā)現(xiàn)4份樣品中的共有OTUs主要來自于放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacter-oidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、螺旋菌門（Spirochaetae）、柔壁菌門（Tenericutes），表明同地域的不同濃香型白酒釀造廠的窖泥細(xì)菌群落類型具有高度的相似性。

基于屬水平的群落結(jié)構(gòu)豐度圖（圖4）直觀地橫向比對(duì)出各份樣品細(xì)菌群落在屬上具有明顯差異，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)Bacteroidetes、Spirochaetae、Firmicutes門類微生物在各樣品中的相對(duì)豐度占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。

圖4 窖泥細(xì)菌群落在屬水平的結(jié)構(gòu)分布Fig.4 Structure distribution of bacterial communities in pit mud at genus level

對(duì)樣品進(jìn)行PCA，發(fā)現(xiàn)30個(gè)OTUs對(duì)窖泥樣品間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異形成具有重要影響（圖5），且全部來源于樣品共有的OTUs中，屬于優(yōu)勢(shì)OTUs。

圖5 對(duì)樣品差異具有重要影響的操作分類單元矩陣的主成分分析Fig.5 Principal component analysis of matrix of operational taxonomic units with important effects on sample difference

2.3 窖泥細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育多樣性分析

經(jīng)過BLAST檢索，優(yōu)勢(shì)OTUs及其參考物種形成見表2。參考物種主要來源于各種各樣的厭氧環(huán)境[3，12-36]，在系統(tǒng)分類上全部歸屬于Bacteroidetes，Spirochaetae，F(xiàn)irmicutes，對(duì)優(yōu)勢(shì)OTUs具有較高的序列相似性（91%～100%）。將參考物種的屬作為釀造的最小功能單元，并代表優(yōu)勢(shì)OTUs解剖窖泥樣品的細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育多樣性，可分析新窖池與成熟窖池形成釀造質(zhì)量差異的原因。

Bacteroidetes微生物在新窖泥樣品LCX中的相對(duì)豐度為31.59%，屬于絕對(duì)優(yōu)勢(shì)類群，而在成熟窖泥樣品中相對(duì)豐度相對(duì)較低，分別為28.33%（YRF）、15.53%（XJF）、2.09%（CXF）。Bacteroidetes的參考物種來源于5個(gè)屬（表2），均具備代謝糖類物質(zhì)產(chǎn)生小分子酸的能力[12-17]，對(duì)寡聚糖、多糖、蛋白質(zhì)等生物大分子具有良好的底物特異性，其代謝活動(dòng)在維持自身繁殖的同時(shí)，也為下游微生物的生長提供基礎(chǔ)性的能源、碳源、氮源等小分子物質(zhì)[13-16]，是窖泥釀造微生態(tài)中主導(dǎo)碳循環(huán)的重要微生物。

表2 優(yōu)勢(shì)操作分類單元矩陣的參考物種Table 2 Reference species of matrix of dominant operational taxonomic units

Spirochaetes門微生物在新窖泥樣品LCX中的相對(duì)豐度顯著低，只有0.07%，在成熟窖泥樣品中的相對(duì)豐度分別為15.92%（YRF）、4.78%（XJF）、1.43%（CXF），只包含planctomycete一個(gè)屬。planctomycete屬的微生物以CO2作為唯一碳源，在厭氧代謝過程將環(huán)境體系中有機(jī)物礦化、硝酸鹽的異養(yǎng)還原作用而產(chǎn)生的NH4+氧化成N2、NO2-或NO3-，并從中獲取繁殖所需的能量[18]，對(duì)窖泥釀造微生態(tài)的氮循環(huán)有促進(jìn)作用。

Firmicutes門微生物被認(rèn)為是窖泥釀造微生態(tài)中產(chǎn)酸產(chǎn)香的關(guān)鍵微生物，其豐度常被用來評(píng)價(jià)窖泥的質(zhì)量[4]。Firmicutes門微生物在窖泥樣品中的多樣性相對(duì)最豐富，主要包含芽孢桿菌綱（Bacilli）與梭菌綱（Clostridia），及相關(guān)的11個(gè)屬（表2）。窖泥樣品中的Bacilli微生物，主要包含乳桿菌屬（Lactobacillus），是代謝合成乳酸的主要微生物[19-21]，其相對(duì)豐度在新窖泥LCX中為23.20%，顯著高于成熟窖泥的0.97%（YRF）、2.41%（XJF）、3.25%（CXF）。窖泥樣品中的Clostridia微生物，特別是其中的梭菌屬（Clostridium），是窖池中合成己酸的釀造關(guān)鍵微生物[22-36]，其相對(duì)豐度在成熟窖泥中分別為36.01%（YRF）、51.26%（XJF）、73.95%（CXF），屬于絕對(duì)優(yōu)勢(shì)微生物。Clostridia微生物在新窖泥LCX中的相對(duì)豐度為21.05%，相對(duì)低于Bacilli微生物的相對(duì)豐度。已有研究表明[1，4]，窖池產(chǎn)己酸能力與Clostridia相對(duì)豐度為正相關(guān)，與Bacilli的相對(duì)豐度呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。Clostridia與Bacilli相對(duì)豐度在新窖泥LCX中為0.907 3%，顯著低于成熟窖泥的相對(duì)豐度37.041 6%（YRF）、21.287 9（XJF）、22.786 8（CXF）?？烧J(rèn)為Clostridia微生物在新窖泥LCX中相對(duì)失調(diào)的豐度是導(dǎo)致新窖池所釀原酒主體香不突出，酒質(zhì)比成熟窖池差的主要原因。

3 結(jié)論

對(duì)新窖泥與成熟窖泥的細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，螺旋菌門（Spirochaetae）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）是新窖泥與成熟窖泥中的共有優(yōu)勢(shì)類群，且Firmicutes微生物的多樣性相對(duì)最豐富；新窖泥中Bacilli微生物的相對(duì)豐度顯著高于成熟窖泥，Clostridia微生物與Bacilli微生物的豐度比顯著低于成熟窖泥。可見濃香型白酒成熟窖泥中“好窖出好酒”的典型細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，是Clostridia占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。以16S rRNA作為分子標(biāo)記研究窖泥環(huán)境細(xì)菌群落，能有效揭示細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育的多樣性，但要充分了解窖泥微生物的代謝特征與釀造質(zhì)量的關(guān)系，還需借助微生物的可培養(yǎng)手段，并構(gòu)建窖泥微生物的miRNA表達(dá)庫，在后續(xù)再深入研究。