果膠酶產(chǎn)生菌的篩選鑒定和酶學(xué)性質(zhì)研究

楊逸飛，雷雨田，趙天恒，宋 琪，閆達(dá)中，彭 芳*

（1.武漢輕工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430023；2.湖北省阿克瑞德檢驗(yàn)檢測(cè)有限公司，湖北 武漢 430077）

果膠酶（pectinase）是指所有能催化分解果膠質(zhì)的一類酶的總稱[1]，屬于一種復(fù)合酶。該復(fù)合酶包括原果膠酶（protopectinase）、聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，PG）、果膠裂解酶（pectate lyase，PL）、果膠甲酯酶（pectinmethylesterase，PE）與纖維素酶（cellulase）等多種酶[2]。盡管自然界中天然果膠酶廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)，但其產(chǎn)量低，難以大量提取，微生物由于生長(zhǎng)周期短，培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單易控制，分布廣等優(yōu)勢(shì)，是果膠酶的重要來源[3-4]?，F(xiàn)代通常采用微生物發(fā)酵的方法，從微生物的代謝產(chǎn)物中提取果膠酶。一般來說果膠酶產(chǎn)生菌主要是真菌和細(xì)菌，在真菌中尤其以曲霉屬最為常見[5-7]。目前，果膠酶廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)的果汁加工和果汁澄清[8-9]以及造紙工業(yè)的紙漿脫膠、紡織和廢水處理等行業(yè)[10]。胡椒（Piper nigrumL.）是重要的熱帶香辛作物，被譽(yù)為“香料之王”，研究發(fā)現(xiàn)果膠是胡椒果皮中胞間層和初級(jí)細(xì)胞壁中起交聯(lián)作用的主要物質(zhì)，胡椒脫皮可以采取水漚法、微生物酶法、微生物發(fā)酵法和冷凍機(jī)械脫皮法。水漚法脫皮耗時(shí)長(zhǎng)（7～15 d），產(chǎn)品外觀差，有“異臭味”。利用微生物酶法、微生物發(fā)酵法等新方法替代傳統(tǒng)胡椒加工方法日益受到重視[11]。國(guó)內(nèi)對(duì)胡椒生物酶法脫皮研究的重點(diǎn)主要聚焦于胡椒脫皮微生物的篩選、鑒定及脫皮效果的分析上[12-13]，微生物來源的果膠酶用于胡椒脫皮報(bào)道并不多，菌種單一，產(chǎn)酶成本高，沒有形成大規(guī)模生產(chǎn)。我國(guó)對(duì)果膠酶的研究、生產(chǎn)起步較晚，盡管果膠酶可以在中國(guó)生產(chǎn)，但品種單一，缺乏高效的果膠酶。面對(duì)果汁和食品加工行業(yè)的快速發(fā)展，許多果膠酶仍需要大量進(jìn)口。因此，亟需篩選具有良好穩(wěn)定性，高活性和高特異性的產(chǎn)果膠酶優(yōu)良菌株，降低酶制劑成本。

本研究從海南胡椒種植園采集土壤，在這種環(huán)境中可能進(jìn)化出可以降解胡椒果皮的微生物，采用剛果紅染色法從土壤中篩選能產(chǎn)生果膠酶的菌株，通過生理、生化實(shí)驗(yàn)以及16S rRNA基因序列分析對(duì)高產(chǎn)果膠酶菌株進(jìn)行鑒定，并對(duì)其所產(chǎn)果膠酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究。以期為利用微生物酶法對(duì)胡椒脫皮的產(chǎn)業(yè)化打下基礎(chǔ)，也為果膠酶的生產(chǎn)提供優(yōu)良的菌種。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品來源

采集海南胡椒種植園的土壤，去掉表層2～3 cm表層土。

1.1.2 化學(xué)試劑

果膠（半乳糖醛酸≥74.0%）：美國(guó)Sigma公司；剛果紅（指示劑級(jí)）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂粉（均為生化試劑）：英國(guó)OXOID公司；3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS），溴甲酚紫、（NH4）2SO4、FeSO4、K2HPO4、MgSO4、NH4NO3、FeCl3、NaCl（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)（上海）化學(xué)試劑有限公司；脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate，dNTP）Mix、Taq酶：寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

液體初篩培養(yǎng)基：K2HPO42.0 g/L、MgSO40.5 g/L、果膠2.0 g/L、調(diào)整pH為7.2～7.4。115 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。分別配制75 g/L（NH4）2SO4和0.5 g/L FeSO4水溶液，過濾除菌后再添加到初篩培養(yǎng)基中（每100mL培養(yǎng)基加入2mL母液），使（NH4）2SO4、FeSO4的終質(zhì)量濃度分別為1.5 g/L 和0.01 g/L。

固體初篩培養(yǎng)基：在上述液體培養(yǎng)基中添加18.0 g/L的瓊脂粉。

發(fā)酵培養(yǎng)基：無機(jī)鹽成分與初篩培養(yǎng)基相同，將果膠的質(zhì)量濃度調(diào)整為4.0 g/L。

LB平板：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，pH 7.4，瓊脂粉15 g/L，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

芽孢桿菌培養(yǎng)基：KCl 0.2 g，MgSO40.2 g，（NH4）2HPO41 g，酵母膏0.2 g，瓊脂粉7 g，糖或醇類10 g，蒸餾水1 000 mL，0.04%溴甲酚紫15 mL。調(diào)整pH為7.2，分裝到試管中使培養(yǎng)基高度約為4～5 cm，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

纖維素?zé)o機(jī)鹽培養(yǎng)基：CaCl20.1 g，K2HPO40.6 g，酵母膏0.05 g，MgSO40.5 g，KH2PO40.5 g，NaCl 1.0 g，NH4NO31.0 g，F(xiàn)eCl30.02 g，羧甲基纖維素8 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.2，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

淀粉培養(yǎng)基：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5 g，可溶性淀粉2 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2～7.4，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min[5]。

明膠培養(yǎng)基：蛋白胨5 g，明膠100～150 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2～7.4，115 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。

半固體穿刺培養(yǎng)基：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5 g，瓊脂粉3～6 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2～7.4。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

LAMBDATM25 Series 紫外可見光分光光度計(jì)：美國(guó)PerkinElmer公司；Biometra TProfessional Thermocycler聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增儀：德國(guó)耶拿分析儀器股份有限公司；ZHJH-C1112B超凈工作臺(tái)、ZWYR-2102C搖床：上海智誠分析儀器有限公司；YXQ-50SⅡ立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司；SPX-300BSH-Ⅱ生化培養(yǎng)箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；5424R高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)艾本德股份公司。

1.3 方法

1.3.1 高產(chǎn)果膠酶菌種的篩選

釋放土壤微生物：將土壤樣品取10 g于滅菌后的錐形瓶中加無菌水100 mL，放入28 ℃、200 r/min搖床72 h釋放土壤中的微生物，制成10%的土壤懸液備用。

初篩：將搖瓶中的上清液梯度稀釋為10-4、10-5、10-6后，各取100μL稀釋液分別涂布于初篩培養(yǎng)基平板上，放入28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約2～3 d，以長(zhǎng)出菌落明顯為宜。選取長(zhǎng)勢(shì)較好的菌落將其轉(zhuǎn)接至另外兩個(gè)初篩培養(yǎng)基平板上，放入28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

復(fù)篩：待長(zhǎng)出菌落明顯后，將一個(gè)平板倒入剛果紅溶液（5 mg/mL水溶液），使其完全覆蓋整個(gè)平板，靜置15 min。再倒去剛果紅溶液，用氯化鈉溶液（1 mol/L）重新覆蓋平板表面，靜置15 min，觀察菌落旁水解圈明顯且較大的菌株[14]。將另外相同平板上水解圈較大的菌株接種于液體初篩培養(yǎng)基中，放入28 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)48 h后，取0.5 mL培養(yǎng)液接種于50 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)72 h后，吸取2 mL上清液，經(jīng)4 ℃、12 000 r/min，30 min離心后作為粗酶液。將粗酶液適當(dāng)稀釋后使用DNS定糖法測(cè)定果膠酶的活力，以此為依據(jù)篩選出活力相對(duì)較高的菌株[15]。

1.3.2 DNS定糖法檢測(cè)果膠酶活力

取培養(yǎng)液10 mL，12 000 r/min離心15 min，取上清液作為粗酶液。用pH值為6.5的K2HPO4-KH2PO4緩沖液10 mL溶解0.05 g的果膠。取1 mL加入EP管中，再加入粗酶液0.5 mL，攪拌器混勻，放入46 ℃水浴鍋中反應(yīng)1 h。取0.13 mL反應(yīng)后的混合液，加入另一EP管中，與0.47 mL的DNS試劑混合均勻。于100 ℃加熱10 min，用石英狹縫比色杯在波長(zhǎng)540 nm處測(cè)定吸光度值，以滅活的酶液作為空白對(duì)照，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，結(jié)果取平均值。果膠酶酶活定義：在46 ℃、pH 6.5的條件下，1.0 mL果膠酶液每分鐘催化果膠生成1 μmol半乳糖醛酸的酶量定義為1個(gè)酶活單位（U/mL）。酶活計(jì)算公式如下[16-17]：

式中：A540nm樣品、A540nm對(duì)照分別為待測(cè)樣品酶和對(duì)照滅活的酶液在波長(zhǎng)540 nm處的吸光度值；D為稀釋倍數(shù)；K為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率；t為反應(yīng)時(shí)間，min。

1.3.3 菌株鑒定

（1）形態(tài)特征

將YY01菌液劃線于LB平板，28 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落形狀、大小、顏色、水溶性色素等特征，并進(jìn)行革蘭氏染色。

（2）生理生化試驗(yàn)

糖、醇類發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性觀察實(shí)驗(yàn)，淀粉水解實(shí)驗(yàn)，纖維素水解實(shí)驗(yàn)，明膠液化實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[18]，根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[19]和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[20]，結(jié)合16S rRNA測(cè)定的結(jié)果，鑒定分離的菌株種屬。

（3）分子生物學(xué)鑒定

將YY01菌液劃線于無機(jī)鹽平板，28 ℃培養(yǎng)24 h，煮沸法提取基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）。采用細(xì)菌通用引物27F和1492R，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增16S rRNA。PCR擴(kuò)增體系（20 μL）：ddH2O 12.8 μL，PCR Buffer（10×）2 μL，引物P1（27F）、P2（1492R）各1 μL，10 mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）Mix 2 μL，Taq酶0.2 μL，模板1 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

擴(kuò)增產(chǎn)物送交生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果提交美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）的GenBank（Accession Number：MF443454）數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行基本局部比對(duì)搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）比對(duì)分析，利用Mega X軟件對(duì)其他幾株類似菌屬的16S rRNA序列進(jìn)行序列一致性和同源性分析。

1.3.4 果膠酶的酶學(xué)性質(zhì)

（1）最適pH值、最適溫度測(cè)定

將果膠酶粗酶液加入到pH 7.0 Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液中，分別測(cè)定30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃條件下酶活力。配制pH值分別為3.0～10.0的Na2HPO4-NaH2PO4和甘氨酸-NaOH緩沖液，將粗酶液加到上述各種不同pH值緩沖液中，測(cè)定45 ℃酶活力。

（2）pH穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性測(cè)定

將粗酶液分別加到pH值為3.0～10.0的緩沖體系中保持12 h后，重新使用緩沖液將pH調(diào)為最適反應(yīng)pH下測(cè)定果膠酶的活力。以最適pH條件下未保溫的酶液測(cè)定的果膠酶活力記為100%，分別計(jì)算出不同pH條件下的相對(duì)酶活，考察酶的pH穩(wěn)定性。酶的溫度穩(wěn)定性測(cè)定：將稀釋后的酶液在30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃下處理6 h，取出1 mL然后立即將溫度調(diào)整至45 ℃放置于pH 7.0緩沖液中測(cè)定果膠酶活性，以不同溫度下未保溫酶液測(cè)定的果膠酶活力記為100%，分別計(jì)算出不同溫度條件下的相對(duì)酶活，考察酶的熱穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)果膠酶菌株的篩選

2.1.1 初篩菌株水解圈大小測(cè)定結(jié)果

能分泌果膠酶的菌株，其菌落周圍的果膠被分解利用，利用剛果紅染色后菌落周圍出現(xiàn)透明圈的原理進(jìn)行初篩，挑選出水解圈較大的菌株作為初篩菌株，結(jié)果見表1。由表1可知，篩選出3株菌落形態(tài)特征明顯不同的菌株，分別命名為1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)，1號(hào)菌落米黃色偏白，圓形中間有小突起；2號(hào)菌落灰白色，邊緣不整齊，有毛刺；3號(hào)菌落灰白色，扁平圓形。其水解圈直徑和菌落直徑的比值分別為8、4、6。

表1 篩選菌株水解圈直徑大小比較Table 1 Comparison of hydrolytic circle diameter of screened strains

2.1.2 復(fù)篩菌株酶活力測(cè)定結(jié)果

將初篩得到的3株菌株平板劃線得到單菌落后，接種于液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵后測(cè)定其產(chǎn)生的粗酶液的酶活力。因?yàn)槊富盍蜏y(cè)定的吸光度值呈正比例線性關(guān)系，故用吸光度值的大小來代表其粗酶液的酶活力的大小，結(jié)果表明，1號(hào)菌所產(chǎn)生的粗酶液的酶活力（97.5 U/mL）顯著高于其他兩個(gè)菌株（2號(hào)和3號(hào)分別為36.3 U/mL，51.8 U/mL）（P＜0.05），標(biāo)記為YY01。經(jīng)過3次連續(xù)傳代培養(yǎng)，菌株YY01在篩選平板形成均勻、水解圈較大且透明的單菌落如圖1所示，菌落質(zhì)地均勻，較光滑、較粘稠、易挑起。在油鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，為桿狀、單個(gè)或線型排列，革蘭氏染色顯示為紫色，表明菌株YY01為革蘭氏陽性菌。因此，進(jìn)一步對(duì)菌株YY01進(jìn)行生理生化試驗(yàn)分析及分子生物學(xué)鑒定。

圖1 菌株YY01的菌落形態(tài)及水解圈Fig.1 Colony morphology and hydrolytic circle of strain YY01

2.2 菌株YY01的鑒定

2.2.1 生理生化特性

將篩選菌株YY01單菌落到接種到相應(yīng)的各種鑒定培養(yǎng)基，對(duì)其進(jìn)行生理生化特性進(jìn)行分析，結(jié)果見表2。由表2可知，菌株YY01的甘露醇、葡萄糖、蔗糖、木糖、阿拉伯糖發(fā)酵結(jié)果均為陽性；淀粉水解、纖維素分解、明膠液化結(jié)果均為陰性，不能運(yùn)動(dòng)。檢索《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，菌株YY01與芽孢桿菌的生理生化特征相吻合。初步斷定本研究篩選的果膠酶產(chǎn)生菌YY01屬于芽孢桿菌（Bacillus）。

表2 菌株YY01的生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical characteristics of strain YY01

2.2.2 菌株YY01的16S rRNA的測(cè)定結(jié)果

PCR擴(kuò)增16S rRNA基因，PCR產(chǎn)物測(cè)序的結(jié)果拼接后，長(zhǎng)度為1 438 bp，利用NCBI 的GenBank數(shù)據(jù)庫的BLAST程序進(jìn)行序列一致性比對(duì)，利用Mega X構(gòu)建16S rRNA基因系統(tǒng)進(jìn)化樹見圖2。由圖2可知，菌株YY01的16S rRNA序列與PF4i 2的序列相似度達(dá)到了99.9%以上。因此，菌株YY01被鑒定為Bacillus niabensis。

圖2 基于菌株16S rRNA基因構(gòu)建的菌株YY01的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain YY01 constructed based on 16S rRNA gene sequence

2.3 果膠酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1 果膠酶最適pH值和最適溫度

由圖3A可知，果膠酶活力隨著pH升高而升高；當(dāng)pH值為7.0時(shí)，果膠酶活力最高，達(dá)到98.8 U/mL。當(dāng)pH值＞7.0以后，果膠酶活性呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。因此，果膠酶最適pH值為7.0。由圖3B可知，隨著發(fā)酵溫度在30～45 ℃范圍內(nèi)升高，果膠酶酶活力逐漸升高，當(dāng)溫度為45 ℃時(shí)，果膠酶酶活最高，酶活力為97.5 U/mL；當(dāng)溫度＞45 ℃之后，果膠酶活呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，到50 ℃時(shí)，果膠酶活急劇下降。因此，果膠酶最適溫度為45 ℃。

圖3 菌株YY01產(chǎn)果膠酶的最適pH（A）及最適溫度（B）Fig.3 Optimum pH (A) and temperature (B) of pectinase produced by strain YY01

pH對(duì)微生物營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和新陳代謝過程中酶的活性存在十分重要的作用，適宜的pH對(duì)菌種發(fā)酵起促進(jìn)作用。溫度對(duì)酶用于食品加工也是非常重要的參數(shù)之一。JOSHI M等[21]從海洋沉積物中分離出來的枯草芽孢桿菌在堿性緩沖液中，在溫度為40 ℃時(shí)，果膠酶的活性最大。王齊瑋等[22]從大麻籽中篩選到7株產(chǎn)果膠酶的最高酶活為21.8 U/mL。本實(shí)驗(yàn)篩選的菌株所產(chǎn)的果膠酶最適溫度為45 ℃時(shí)，酶活力為97.5 U/mL，具有較好的應(yīng)用前景。

2.3.2 果膠酶的pH穩(wěn)定性與溫度穩(wěn)定性

由圖4A可知，不同pH保溫12 h后，果膠酶在pH 8.0時(shí)有75%的殘余酶活力，在pH 10時(shí)仍有52.5%的殘余酶活力。由圖4B可知，果膠酶在40 ℃時(shí)保溫6 h后有78.5%的殘余酶活力，在50 ℃時(shí)保溫6 h后仍具有64%的殘余酶活力。由此可見，該菌株產(chǎn)果膠酶具有一定耐堿性和耐高溫性。尹樂斌等[23]從果園土壤中篩選的一株高產(chǎn)果膠酶，發(fā)現(xiàn)在不同pH 4.0～7.0下，處理1 h，該酶還有50%的殘留酶活力；在30～50 ℃條件下，處理1 h，該酶還有80%的殘留酶活力。于平等[24]研究表明，從土壤中篩選的枯芽孢桿菌ZGL14，在50 ℃保溫100 min有86.7%的酶活力；在pH 10的條件下保溫100 min，仍有50.1%的酶活力。但在工業(yè)生產(chǎn)和果汁加工工藝研究中，果膠酶的酶解時(shí)間一般為2～5 h，酶解溫度為45 ℃[25-27]。以往的相關(guān)研究報(bào)道在時(shí)間上處理相對(duì)較短，與生產(chǎn)實(shí)際應(yīng)用具有一定的差距。本實(shí)驗(yàn)篩選的菌株YY01產(chǎn)生的果膠酶，在耐堿性和耐高溫性上，更符合果汁生產(chǎn)工藝的需要，具有開發(fā)用于果汁加工和胡椒脫皮的應(yīng)用前景。

圖4 菌株YY01產(chǎn)果膠酶的pH（A）及溫度（B）穩(wěn)定性Fig.4 Stability of pH (A) and temperature (B) of pectinase produced by strain YY01

3 結(jié)論

以果膠為唯一碳源，從海南寄送的泥土作為材料，通過稀釋平板涂布直接篩選和搖瓶傳代培養(yǎng)的方法篩選出一株產(chǎn)果膠酶菌株，經(jīng)16S rRNA測(cè)序分析，結(jié)合生理生化實(shí)驗(yàn)，革蘭氏染色等，將其鑒定為Bacillus niabensis。測(cè)定該菌株所產(chǎn)果膠酶的酶學(xué)性質(zhì)，果膠酶的最適pH值為7.0，最適溫度為45 ℃；在pH 10.0時(shí)孵育12 h，仍有52.5%殘余酶活力；在50 ℃時(shí)孵育6 h，有64%殘余酶活力，表現(xiàn)出了較好的酸堿耐受性和熱穩(wěn)定性，有應(yīng)用到食品加工的潛力。