不同剩余采食量的蛋鴨盲腸微生物組成及多樣性研究

楊 速 白 天 操勇清 黃學(xué)濤 陳斌丹 王武強(qiáng) 沈軍達(dá) 田 勇 李國勤 陶爭榮 陳 黎 趙阿勇 盧立志 曾 濤*

(1.浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，金華 321004；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，杭州 310021；3.浙江農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，杭州 311300；4.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730000；5.諸暨市國偉禽業(yè)發(fā)展有限公司，紹興 311800；6.縉云縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，麗水 321400)

近年來，我國蛋鴨育種工作有些突破，但蛋鴨的飼料利用率相較于雞和肉鴨仍然較低，而飼料成本在現(xiàn)代家禽生產(chǎn)中約占總成本的70%[1]，因此研究有效提高蛋鴨飼料利用率的技術(shù)體系及其機(jī)制，對提升我國蛋鴨生產(chǎn)養(yǎng)殖水平和產(chǎn)業(yè)科技發(fā)展具有重要意義。Koch等[2]提出的剩余采食量(residual feed intake，RFI)是目前衡量家禽飼料利用率的理想選擇指標(biāo)。RFI指維持機(jī)體代謝過程和生產(chǎn)所需的期望采食量與實(shí)際采食量的差值[3]。研究表明，RFI能通過有效的個(gè)體選擇進(jìn)行改良[4-6]。Faure等[7]以RFI為選育指標(biāo)，經(jīng)過對大白豬6個(gè)世代的選育之后，平均日增重相同(760 g/d)，但低RFI組比高RFI組平均日采食量減少216 g/d，飼料轉(zhuǎn)化率提高11.7%。Bordas等[8]對產(chǎn)蛋雞的飼料利用率進(jìn)行了17代選育后發(fā)現(xiàn)，低RFI組的孵化率比高RFI組高30%。研究發(fā)現(xiàn)，選擇低RFI的番鴨飼養(yǎng)至7周齡可提高飼料利用率[9]。本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，蛋鴨RFI與采食量(FI)、飼料轉(zhuǎn)化率呈極顯著的正相關(guān)，表明在蛋鴨育種中選擇低RFI的蛋鴨能夠提高飼料利用率[10-11]。

腸道微生物與宿主的相互作用所構(gòu)成的腸道微生物系統(tǒng)越來越受到關(guān)注，腸道微生物對宿主的影響包括代謝、免疫和行為等[12-13]。其中，腸道微生物對家禽營養(yǎng)吸收的影響是畜牧學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。家禽腸道較短，食糜排空快，但在盲腸中停留時(shí)間較長，以供微生物發(fā)酵[14]。與其他腸段相比，家禽盲腸中微生物數(shù)量最多，產(chǎn)生的非淀粉多糖酶可將小腸無法消化吸收的非淀粉多糖發(fā)酵成短鏈脂肪酸，對促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)吸收和提高飼料轉(zhuǎn)化率至關(guān)重要[15-16]。除了可以發(fā)酵飼料中難以消化的成分，某些腸道微生物也可以通過產(chǎn)生抗炎代謝物促進(jìn)腸道健康，保證腸道正常功能，從而提高營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收[17]。對不同動(dòng)物的大量研究表明，腸道微生物與飼料利用率存在相關(guān)性。在豬方面，高飼料利用率的豬腸道微生物有更多利用食物中多糖和蛋白質(zhì)的能力，其可能通過發(fā)酵多糖產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸(volatile fatty acid，VFA)改善腸道健康，進(jìn)而提高豬的飼料利用率[18]。在反芻動(dòng)物方面，Guan等[19]研究發(fā)現(xiàn)，高RFI和低RFI組牛瘤胃微生物菌群結(jié)構(gòu)存在顯著差異；腸道菌群中的琥珀酸菌屬、優(yōu)桿菌屬等與RFI相關(guān)，其可能的作用機(jī)理是通過參與VFA的合成與吸收，調(diào)節(jié)宿主的能量代謝，進(jìn)而影響機(jī)體RFI[20]。在家禽方面，不同飼料利用率肉雞在6個(gè)分類水平上優(yōu)勢菌群種類一致，但相對豐度存在差異[21]；不同產(chǎn)蛋率下肉雞腸道菌群存在差異，并進(jìn)而影響肉雞繁殖性能[22]；在產(chǎn)蛋雞上，盲腸微生物多樣性較十二指腸和糞便微生物多樣性高，對飼料利用率發(fā)揮著重要作用[23]。這些研究結(jié)果表明，畜禽RFI與腸道微生物群落多樣性及菌群組成、功能存在一定的聯(lián)系。因此，本研究旨在通過比較不同RFI蛋鴨個(gè)體的盲腸微生物組成，篩選候選差異菌群，為今后通過調(diào)控腸道菌群提高蛋鴨飼料利用率提供思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物和基礎(chǔ)飼糧

試驗(yàn)選取400日齡的紹興鴨300只，由紹興市諸暨市國偉禽業(yè)紹興鴨國家級保種場提供。采用3層梯形式籠舍進(jìn)行單籠飼養(yǎng)，每個(gè)籠位用隔板隔開，以避免因相互啄食飼料而造成試驗(yàn)誤差?；A(chǔ)飼糧選用產(chǎn)蛋鴨高峰期顆粒狀配合飼料(蛋倍利)，購自上海香川飼料有限公司。預(yù)試期10 d，正試期60 d(410～470日齡)，期間紀(jì)錄每個(gè)個(gè)體的采食量、平均蛋重(EML)、初始體重(IBW)、終末體重(FBW)，并計(jì)算每個(gè)個(gè)體的增重(GW)和代謝體重(BW0.75)。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis)

1.2 RFI測定

RFI測定利用多元線性回歸方程計(jì)算個(gè)體RFI并排序，選取RFI最高和最低的各15只鴨，分別為高RFI組(HRFI組)和低RFI組(LRFI組)，屠宰后采集盲腸內(nèi)容物，置于-80 ℃超低溫冰箱保存。

RFI模型如下：

RFI=FI-(μ+a×BW0.75+b×GW+c×EML)[24]。

式中：FI為采食量；μ為截距；a、b、c為偏回歸系數(shù)；BW0.75為代謝體重；GW為增重；EML為平均蛋重。

1.3 腸道微生物檢測

使用德國QIAGEN公司的QIAamp Fast DNA Stool Mini試劑盒提取盲腸微生物總DNA。經(jīng)DNA質(zhì)檢過后，HRFI組共提取到有效樣本13個(gè)，LRFI組共提取到有效樣本11個(gè)。以提取的基因組DNA為模板，根據(jù)測序區(qū)域選擇帶有barcode的特異引物，使用上游引物(F341：5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′)和下游引物(R805：5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′)對細(xì)菌V3+V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性45 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共28個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。將PCR擴(kuò)增所獲得的產(chǎn)物通過2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，并對目標(biāo)片段進(jìn)行切膠回收，于-20 ℃保存。后續(xù)測序由浙江天科高新技術(shù)發(fā)展有限公司完成。本試驗(yàn)采用QIIME2(2019.4)、R語言等軟件對盲腸微生物進(jìn)行Alpha多樣性分析，采用主坐標(biāo)分析(PCoA)、主成分分析(PCA)和無度量定標(biāo)(MNDS)法進(jìn)行Beta多樣性分析，采用STAMP軟件分析組間差異菌群。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2019和SPSS 22.0對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和統(tǒng)計(jì)分析，采用t檢驗(yàn)和Wilcox秩和檢驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”(mean±SE)表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同RFI蛋鴨生產(chǎn)性能比較

由表2可知，HRFI組RFI、采食量極顯著高于LRFI組(P<0.01)，2組之間RFI差值達(dá)到了63.35 g/d，采食量差值達(dá)到了57.00 g/d。HRFI組料蛋比極顯著高于LRFI組(P<0.01)。2組之間增重、平均蛋重、產(chǎn)蛋率和體重均無顯著差異(P>0.05)，說明RFI的高低對蛋鴨體重、增重、平均蛋重和產(chǎn)蛋率沒有顯著影響。

表2 不同RFI蛋鴨生產(chǎn)性能比較Table 2 Comparison of performance of laying ducks with different RFI

2.2 Alpha多樣性分析

2.2.1 稀釋曲線和相對豐度等級曲線

由圖1可知，稀釋曲線圖中，HRFI組各樣本稀釋曲線較LRFI組短且更平緩，說明LRFI組物種相對豐度較HRFI組高。相對豐度等級曲線圖中，LRFI組相對豐度等級曲線在垂直方向上較為平緩且在水平方向上跨度較大；HRFI組各樣品相對豐度等級曲線在垂直方向上與LRFI組差異不大，在水平方向上跨度均較小，說明LRFI組相對豐度等級較HRFI組高，但物種分布均勻度差異不大。

H：高剩余采食量組 HRFI group；L：低剩余采食量組 LRFI group。

2.2.2 Alpha多樣性指數(shù)分析

由圖2可知，LRFI組Chao1指數(shù)顯著高于HRFI組(P=0.018 9)，說明LRFI組在菌群豐富度上高于HRFI組；LRFI組Shannon指數(shù)顯著高于HRFI組(P=0.025 7)，說明LRFI組菌群多樣性高于HRFI組；HRFI組和LRFI組Simpson指數(shù)均高于0.95，并且LRFI組高于HRFI組(P>0.05)，說明HRFI組和LRFI組的組內(nèi)菌群多樣性和均勻度均較高。

圖2 不同RFI組盲腸微生物Alpha多樣性Fig.2 Alpha diversity of cecal microorganisms of different RFI groups

2.2.3 Beta多樣性分析

由圖3可知，由PCoA圖可見，HRFI組與LRFI組的微生物群落分離明顯，表明2組樣本菌群結(jié)構(gòu)存在差異，主坐標(biāo)1占比55.57%，主坐標(biāo)2占比13.25%；由PCA圖可見，主成分1占比12.17%，主成分2占比8.69%；由NMDS圖可見，落在<0.2內(nèi)的點(diǎn)占絕大多數(shù)，表明數(shù)據(jù)分析可靠性高。

圖3 不同RFI組PCoA、PCA和NMDS圖Fig.3 PCoA, PCA and NMDS figures of different RFI groups

2.3 微生物群落結(jié)構(gòu)分析

2.3.1 門水平上菌群結(jié)構(gòu)

由圖4可知，在門水平上，LRFI組蛋鴨腸道優(yōu)勢菌群為厚壁菌門(Firmicutes)，HRFI組優(yōu)勢菌群為變形菌門(Proteobacteria)，而擬桿菌門(Bacteroidetes)在2組中差異較小。2組物種相對豐度排名前5的菌群包括Bacteroidetes(50.6%)、Firmicutes(31.43%)、Proteobacteria(7.17%)、梭桿菌門(Fusobacteria)(4.06%)和脫鐵桿菌門(Deferribacteres)(2.00%)。其中，HRFI組Proteobacteria、Fusobacteria、Deferribacteres和Bacteroidetes相對豐度較LRFI組高，分別高2.12%、1.53%、1.31%和0.99%；而LRFI組僅Firmicutes相對豐度較HRFI組高，高4.75%。

圖4 HRFI組和LRFI組門水平優(yōu)勢菌群Fig.4 Dominant flora of HRFI group and LRFI group at phylum level

2.3.2 屬水平上菌群結(jié)構(gòu)

根據(jù)操作分類單元(OTUs)結(jié)果在屬水平對2組排名前10的微生物菌屬進(jìn)行分析。由圖5可知，2組相對豐度排名前10的微生物菌屬組成相同，包括擬桿菌屬(Bacteroides)、糞桿菌屬(Faecalibacterium)、普雷沃氏菌科_Ga6A1(Prevotellaceae_Ga6A1_group)、梭桿菌屬(Fusobacterium)、理研菌科_RC9(Rikenellaceae_RC9_gut_group)、厭氧螺菌屬(Anaerobiospirillum)、脫鐵桿菌屬(Mucispirillum)、考拉桿菌屬(Phascolarctobacterium)、瘤胃菌科_UGG-014(Ruminococcaceae_UCG-014)和副桿菌屬(Parabacteroides)。其中，HRFI組Bacteroides、Faecalibacterium、Anaerobiospirillum、Mucispirillum和Fusobacterium相對豐度均高于LRFI組，分別高3.71%、2.68%、2.09%、1.81%和1.53%；而LRFI組其余5個(gè)菌屬總相對豐度比HRFI組高1.57%，其他未知微生物菌屬相對豐度比HRFI組高7.90%。

圖5 HRFI組和LRFI組屬水平上排名前10的微生物菌屬Fig.5 Top 10 microorganism genus in HRFI group and LRFI group at genus level

2.4 不同RFI個(gè)體盲腸菌群差異分析

為分析HRFI組和LRFI組的差異菌群，進(jìn)行組間t檢驗(yàn)。由圖6可知，在屬水平，共有18個(gè)差異菌群，其中HRFI組僅有支原體屬(Mycoplasma)相對豐度極顯著高于LRFI組(P<0.01)；LRFI組中，Rikenellaceae_RC9_gut_group、產(chǎn)糞甾醇真桿菌([Eubacterium]_coprostanoligenes_group)、瘤胃菌科_UGG-010(Ruminococcaceae_UCG-010)、巴氏桿菌(Barnesiella)、瘤胃球菌屬_2(Ruminococcus_2)、乳梭菌屬(Lachnoclostridium)、瘤胃菌科_NK4A214(Ruminococcaceae_NK4A214_group)、瘤胃菌科_UCG-009(Ruminococcaceae_UCG-009)、斯萊克氏菌屬(Olsenella)、艾伯森桿菌屬(Eisenbergiella)、互營球菌屬(Syntrophococcus)、艾諾瑪菌屬(Enorma)、大腸桿菌-至賀氏菌屬(Escherichia-Shigella)、小紡錘狀菌屬(Fusibacter)相對豐度顯著高于HRFI組(P<0.05)，克里斯滕森菌科_R-7(Christensenellaceae_R-7_group)、顫桿菌克屬(Oribacterium)、乳頭桿屬(Papillibacter)相對豐度極顯著高于HRFI組(P<0.01)。

圖6 屬水平上HRFI組和LRFI組組間菌群差異分析Fig.6 Analysis of bacterial community differences between HRFI and LRFI groups at genus level

3 討 論

3.1 不同RFI對蛋鴨生產(chǎn)性能的影響

本研究顯示，HRFI組蛋鴨采食量、RFI和料蛋比均極顯著高于LRFI組，而RFI對蛋鴨體重、增重、平均蛋重、產(chǎn)蛋率均無顯著影響。之前在紹興鴨和縉云麻鴨上的研究表明，RFI與采食量呈極顯著正相關(guān)[10]，而在北京肉鴨上的研究表明，RFI與采食量、飼料轉(zhuǎn)化率呈中度正相關(guān)[25]，這與本研究結(jié)果一致。對奶牛的研究表明，RFI最低的個(gè)體比RFI最高的個(gè)體節(jié)約了15%的飼料[26]，而選育低RFI的肉牛也能達(dá)到顯著減少飼料消耗的目的[27]。對羊的研究表明，RFI與干物質(zhì)采食量呈顯著正相關(guān)，而RFI對羊體重、平均日增重等無顯著影響[28]，這與本研究結(jié)果一致。

3.2 不同RFI對蛋鴨盲腸微生物多樣性的影響

大量研究表明，畜禽的生產(chǎn)性能、飼料利用率和RFI與腸道微生物的組成存在相關(guān)性。本研究將同一場地內(nèi)相同飼養(yǎng)管理?xiàng)l件且遺傳背景相似的紹興鴨分成HRFI和LRFI組，通過比較盲腸微生物多樣性和差異菌群，嘗試在盲腸微生物與RFI之間建立聯(lián)系。對豬[29-31]和雞[21]腸道微生物與飼料轉(zhuǎn)化率的關(guān)聯(lián)研究表明，飼料轉(zhuǎn)化率高的個(gè)體Alpha多樣性更高或趨于更高。本研究中，豐富度曲線、Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均表明LRFI組菌群Alpha多樣性高于HRFI組，與之前的研究結(jié)果一致。

3.3 不同RFI對蛋鴨門水平上盲腸微生物結(jié)構(gòu)的影響

本研究中，在門水平上，LRFI組蛋鴨腸道優(yōu)勢菌群為Firmicutes，HRFI組優(yōu)勢菌群為Proteobacteria，而Bacteroidetes在2組中差異較小。El等[32]研究表明，F(xiàn)irmicutes和Bacteroidetes為主要編碼碳水化合物活性酶的菌群。腸道內(nèi)Firmicutes與Bacteroidetes的比例(F/B)會(huì)影響宿主從食物中獲取能量的能力[33]。對大鼠的研究表明，在食物誘導(dǎo)的肥胖個(gè)體中F/B更高[34]。肥胖人群中Bacteroidetes相對豐度高于較瘦人群，當(dāng)持續(xù)減少攝入的熱量，體重逐漸降低，F(xiàn)irmicutes相對豐度逐漸減小[35]。Firmicutes是不同RFI豬群腸道的主要差異菌群[36]。Han等[37]研究了不同體重?cái)嗄套胸i腸道菌群的差異，在體重較高的仔豬腸道中，F(xiàn)irmicutes對豐度高于體重較低的個(gè)體；相反，Bacteroidetes和Proteobacteria對豐度在體重較低的個(gè)體中更高。這與在人和哺乳動(dòng)物上的研究結(jié)果相似，家禽盲腸中Firmicutes相對豐度與體增重[38]和產(chǎn)蛋性能[22]存在正相關(guān)。另一項(xiàng)研究表明，早期在雞上使用抗生素會(huì)減少Firmicutes相對豐度，增加Proteobacteria相對豐度；在后期，低Firmicutes相對豐度的個(gè)體T細(xì)胞免疫活性降低[38]，揭示了Firmicutes和Proteobacteria對宿主免疫功能的影響。

3.4 不同RFI對蛋鴨屬水平上盲腸微生物結(jié)構(gòu)的影響

在屬水平上，HRFI組與LRFI組蛋鴨腸道菌群相對豐度排名前10的菌屬相同，其中LRFI組Rikenellaceae_RC9_gut_group、Phascolarctobacterium和Parabacteroides相對豐度高于HRFI組。Rikenellaceae是產(chǎn)蛋雞相對豐度最高的3個(gè)菌群之一[40]，同時(shí)也是肉雞[21]和豬[10]盲腸中的優(yōu)勢菌群，可以促進(jìn)飼糧中蛋白質(zhì)和碳水化合物的分解[41]。對大鼠的研究表明，在飼糧中添加高水平的脂肪，Phascolarctobacterium和Parabacteroides相對豐度隨之升高，且二者的相對豐度可能與體增重、體脂率以及代謝水平的變化有關(guān)[42]。此外，Parabacteroides可以通過誘導(dǎo)抗炎因子的產(chǎn)生以及抑制炎癥因子的分泌減少腸道炎癥反應(yīng)，維持腸道正常功能[17]。

3.5 不同RFI對蛋鴨盲腸微生物結(jié)構(gòu)差異的影響

本研究中，HRFI組和LRFI組蛋鴨存在18個(gè)差異菌群，其中HRFI組僅Mycoplasma相對豐度顯著高于LRFI。之前的研究顯示，Mycoplasma將碳水化合物作為主要能量物質(zhì)，且在正常飼喂條件下哺乳動(dòng)物腸道中很少見Mycoplasma[43]，豬糞便中Mycoplasma相對豐度與丁酸含量呈正相關(guān)[29]，膳食纖維組仔豬腸道菌群中Mycoplasma相對相對豐度顯著降低，表明Mycoplasma可能與宿主競爭性利用碳水化合物，且不能幫助代謝不易消化吸收的膳食纖維，進(jìn)而影響宿主飼料利用率。其余17個(gè)差異菌群中12個(gè)為厚壁菌門，2個(gè)為擬桿菌門。其中厚壁菌門的[Eubacterium]_coprostanoligenes_group[30,44]、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)[30,42]、克里斯滕森菌科(Christensenellaceae)[36]和瘤胃球菌屬(Ruminococcus)[45]對促進(jìn)宿主消化吸收營養(yǎng)物質(zhì)或提高飼料利用率有積極作用。

4 結(jié) 論

LRFI組蛋鴨盲腸微生物多樣性較高，2組菌群結(jié)構(gòu)存在差異。門水平上，LRFI組蛋鴨盲腸優(yōu)勢菌群為Firmicutes，HRFI組優(yōu)勢菌群為Proteobacteria；屬水平上，LRFI組Christensenellaceae_R-7_group、Oribacterium、Papillibacter等17個(gè)菌群相對豐度高于HRFI組，而HRFI組僅Mycoplasma相對豐度高于LRFI組。