高溫煅燒貝殼粉的抗菌除霉性能研究

安 鑫 汪之和*

（上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306）

貝類產(chǎn)量是我國(guó)漁業(yè)資源中僅次于魚(yú)類的第二大水產(chǎn)資源，根據(jù)《中國(guó)漁業(yè)年鑒》[1]統(tǒng)計(jì)：2019 年我國(guó)貝類養(yǎng)殖產(chǎn)量約1458 萬(wàn)噸，捕撈量約62 萬(wàn)噸。目前貝類的利用僅限于肉質(zhì)部分，按貝殼占比60%計(jì)算[2]，2019 年產(chǎn)生約912 萬(wàn)噸貝殼，大多數(shù)貝殼資源未能得到有效利用，并在一定程度上造成對(duì)環(huán)境的污染[3]。廢棄貝殼的積累已成為真正的環(huán)境問(wèn)題，特別是在貝類養(yǎng)殖區(qū)或沿海地帶。這些貝殼通常有肉質(zhì)殘留，在自然條件下，這些有機(jī)物會(huì)被微生物分解，釋放出有毒有害的氨、硫化氫和烴類氣體[3]。廢棄貝殼的堆積也會(huì)造成沿海水域污染加劇、生態(tài)環(huán)境惡化、生物資源減少等問(wèn)題。

為了減少貝殼資源的浪費(fèi)，已有許多學(xué)者將貝殼作為抗菌劑進(jìn)行相關(guān)研究。比如將貝殼經(jīng)過(guò)高溫煅燒后制得活性氧化鈣，比較不同貝殼煅燒產(chǎn)物對(duì)革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌的殺菌作用[4]。還有海洋貝殼提取物對(duì)霉菌和酵母菌的抑制作用，使其在食物的保鮮以及防腐也有著重要的應(yīng)用。煅燒貝殼活性鈣已經(jīng)在美國(guó)和日本被允許作為食品添加劑，Young[5]等人研究了添加牡蠣殼對(duì)豆腐品質(zhì)和貨架期的影響，豆腐的口感好，硬度適中，并且保質(zhì)期比使用氯化鎂的豆腐延長(zhǎng)2 天以上。這種活性氧化鈣使得煅燒貝殼粉不僅對(duì)常見(jiàn)致病菌有殺菌和抑菌作用，而且在黑曲霉等霉菌的抑制上也有良好的作用。在日本建筑業(yè)，主要是通過(guò)在涂料中添加煅燒牡蠣殼粉防止墻面發(fā)霉[6]。煅燒貝殼粉還可增強(qiáng)其他材料抗菌性能，提高復(fù)合材料的抑菌效果[7-9]。

本文利用高溫煅燒貝殼粉為抑菌劑, 選擇最具代表性的金黃色葡萄球菌和大腸埃希氏菌做供試菌，研究貝殼粉對(duì)兩種致病菌的抗菌性能和殺菌作用，以及抑菌圈試驗(yàn)。同時(shí)測(cè)定貝殼粉的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度；同時(shí)以黑曲霉菌為供試菌測(cè)定貝殼粉防霉性能，為高溫煅燒貝殼粉作為抗菌劑應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

材料：太平洋牡蠣（Crassostrea gigas）購(gòu)于上海市蘆潮港生鮮市場(chǎng)；供試菌株：大腸桿菌（ATCC25922）、金黃色葡萄球菌（ATCC6538）、黑曲霉菌（ATCC16404）均取自上海海洋大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室，由國(guó)家級(jí)菌種保藏機(jī)構(gòu)提供。

試劑：營(yíng)養(yǎng)瓊脂、營(yíng)養(yǎng)肉湯（NB）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基均為北京雙旋微生物培育制品廠生產(chǎn)；無(wú)菌水；氧化鈣，分析純。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

QL-861 型旋渦混合器：海門(mén)市麒麟醫(yī)用儀器廠；JY-150B超聲波破碎儀：北京天恩瀚拓科技有限公司；ZWY 全溫型搖床：常州金壇娘友公司；S2 pH 計(jì)：上海梅特勒- 托利多儀器有限公司；SW-CJ-1F 型超凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；DSX-280A 型不銹鋼手提式滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；UV-2000 型紫外分光光度計(jì)：尤尼柯上海儀器有限公司；ALC-110，ACCULAB 型電子天平：鞏義市予華儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 煅燒貝殼粉的制備

貝殼預(yù)處理: 水煮貝殼直到開(kāi)口，去除內(nèi)臟和閉殼肌，浸泡24h 后將表面處理干凈。在自然光照下晾干2d 后，用去離子水清洗，并破碎成0.3cm 左右小塊。并置于稀醋酸溶液浸泡2h，再用去離子水清洗，將貝殼置入烘箱70℃恒溫烘干20h，冷卻后粉碎，過(guò)100 目篩，得到100μm 左右的貝殼粉[10]。

將貝殼粉末置于1100℃的溫度下進(jìn)行煅燒處理，稱取適量粉碎好的貝殼粉坩堝中，設(shè)置溫度1100 ℃，煅燒時(shí)間為2 h，冷卻煅燒后的樣品均保存在密閉容器中，以避免使用前與二氧化碳和空氣中的水分發(fā)生反應(yīng)。

1.2.2 煅燒貝殼粉懸濁液的制備

參考GB/T 21510-2008 納米無(wú)機(jī)材料抗菌性能檢測(cè)方法[11]，用生理鹽水配制濃度為0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1.0%的高溫煅燒貝殼粉懸濁液。為了保證粉末在液體中分散均勻，采用超聲波分散3min，保證全部分散成均勻懸濁液。

1.2.3 試驗(yàn)菌種活化及菌懸液的制備

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌：參考GB/T21510-2008 納米無(wú)機(jī)材料抗菌性能檢測(cè)方法[11]，對(duì)供試菌種進(jìn)行活化分離、純化，在37℃培養(yǎng)24h 得到第三代培養(yǎng)物。取活化后的第三代培養(yǎng)物稀釋成濃度為105cfu/mL 的菌懸液。

黑曲霉菌：在無(wú)菌操作臺(tái)上將霉菌孢子接種在PDA 培養(yǎng)基斜面上，28℃培養(yǎng)至斜面長(zhǎng)滿黑色霉菌孢子。取10 mL 無(wú)菌水倒入PDA 培養(yǎng)基斜面，用無(wú)菌接種環(huán)輕刮菌種表面洗出孢子，并倒入含玻璃珠的無(wú)菌水中，振蕩使孢子團(tuán)分散，并用無(wú)菌快速定性濾紙過(guò)濾，除去菌絲碎片、瓊脂塊和孢子團(tuán)。4000 rpm 離心，收集孢子沉淀并用50 mL 無(wú)菌水清洗，再次離心并收集沉淀，洗滌3 次，最后用無(wú)菌無(wú)機(jī)鹽營(yíng)養(yǎng)液稀釋，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，使孢子液中孢子含量為1×106個(gè)/mL～5×106個(gè)/mL。

1.2.4 煅燒貝殼粉抑菌性能測(cè)定

將5mL 菌懸液添加至95mL 制備好的貝殼粉懸濁液（0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1.0%），置于恒溫37℃振蕩器中振蕩培養(yǎng)，選用分析純微米尺度二氧化硅粉末作為對(duì)照組，振蕩時(shí)間為24 小時(shí)，進(jìn)行平板法菌落計(jì)數(shù)。

根據(jù)公式計(jì)算試驗(yàn)菌的增長(zhǎng)值F。對(duì)金黃色葡萄球菌及大腸桿菌等細(xì)菌，當(dāng)F≥1.5，且對(duì)照燒瓶中的活菌濃度比接種時(shí)的活菌濃度增加時(shí)，試驗(yàn)判定為有效。否則試驗(yàn)無(wú)效，需重新進(jìn)行試驗(yàn)。

F=lgWt-lgW0

式中：

F：對(duì)照樣的試驗(yàn)菌增長(zhǎng)值;

Wt：對(duì)照樣24h 振蕩接觸后燒瓶?jī)?nèi)的活菌濃度的平均值(cfu/mL);

W0：對(duì)照樣“0”接觸時(shí)間燒瓶?jī)?nèi)的活菌濃度的平均值(cfu/mL)。

1.2.5 煅燒貝殼粉殺菌作用時(shí)間研究

測(cè)定1.0%含量的貝殼粉懸液不同作用時(shí)間，對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的殺菌率。細(xì)菌初始濃度配制為108cfu/mL，作用時(shí)保持振蕩，使貝殼粉一直懸浮均勻，振蕩時(shí)間（作用時(shí)間）分別為0、10、20 及30 min，對(duì)照組選用分析純微米尺度二氧化硅粉末，殺菌溫度為26℃[11]。

1.2.6 濾紙片法測(cè)定煅燒貝殼粉抑菌作用

選取大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為測(cè)試菌種，將載有樣品的濾紙片置于涂有菌液的瓊脂培養(yǎng)基中，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 小時(shí)，測(cè)量抑菌圈的寬度[12]。抑菌帶寬度(H)的計(jì)算如式所示：

H=(D-d)/2

其中：D 為抑菌帶外徑的平均值(mm)；d 為樣品的直徑(mm)。

圖1 抑菌帶寬度計(jì)算示意圖

用移液槍分別吸取無(wú)菌水、0.01%、0.05%、0.1%、0.5%及1.0%三種混懸液各20μL 注入到對(duì)應(yīng)的小圓片的正中央，自然晾干待用。濾紙片僅一側(cè)滴加樣品，搖晃懸液，使懸液均勻。在37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 小時(shí)，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈尺寸。

1.2.7 最小抑菌濃度的測(cè)定（MIC）

采用生理鹽水配制濃度為1.0%的貝殼粉懸液，并進(jìn)行系列對(duì)倍稀釋，混勻待用；含抗菌劑培養(yǎng)液配制：分別取各稀釋度樣品2.5 mL 和營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液2.5 mL 于潔凈的試管內(nèi)，陽(yáng)性對(duì)照組用2.5 mL 的生理鹽水代替樣品[12]。所有試管加液完后蒸汽滅菌。待冷卻至室溫，用超聲波分散3 min，添加0.1 mL 菌懸液并晃動(dòng)均勻。將整個(gè)試管架置于恒溫振蕩箱中，37℃振蕩24h，轉(zhuǎn)速200 rpm。24h 后對(duì)所有試管的渾濁度進(jìn)行比對(duì)，判定其MIC。

1.2.8 最小殺菌濃度的測(cè)定（MBC）

在最小抑菌濃度的基礎(chǔ)上，選擇培養(yǎng)液開(kāi)始渾濁周圍幾個(gè)稀釋度，進(jìn)一步對(duì)培養(yǎng)后的培養(yǎng)液進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，得出最小殺菌濃度。方法同MIC 的測(cè)定，在超凈臺(tái)內(nèi)，用無(wú)菌移液槍各吸取1 mL 上述篩選出的樣本于無(wú)菌平皿內(nèi)，并注入25 mL 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基搖晃均勻，待其自然凝固，將平皿倒置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。觀察培養(yǎng)24h 后的平皿中細(xì)菌生長(zhǎng)情況，比對(duì)菌落數(shù)量，判定其MBC。

1.2.9 煅燒貝殼粉對(duì)黑曲霉的抑制研究

殺霉率測(cè)定：采用1%的貝殼粉準(zhǔn)確稱取1.00g 樣品（貝殼粉）和對(duì)照（微米級(jí)二氧化硅粉）于干燥潔凈的250 mL 錐形瓶中。用生理鹽水配置培養(yǎng)液，沙氏液體培養(yǎng)基的含量為正常沙氏液體培養(yǎng)基溶液的五百分之一。在恒溫振蕩箱中振蕩12 h（調(diào)節(jié)溫度為28℃，轉(zhuǎn)速150 rpm），振蕩后的培養(yǎng)液進(jìn)行10 倍梯度系列稀釋，從每個(gè)稀釋倍數(shù)的液體中分別吸取0.1 mL，加入準(zhǔn)備好的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA) 平板中，用無(wú)菌玻璃推棒涂布均勻。平皿倒置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，對(duì)平皿中霉菌菌落數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算殺霉率[13]。

防霉性能的測(cè)定：采用1.0%貝殼粉懸浮液測(cè)定其對(duì)黑曲霉的防霉性能，采用經(jīng)驗(yàn)證不具有防霉性能的微米級(jí)二氧化硅粉作為對(duì)照。接種后，將平板置于28℃（相對(duì)濕度90%±5%）的條件下培養(yǎng)28 天[13，14]。防霉效果評(píng)價(jià)見(jiàn)表1。

表1 防霉效果評(píng)價(jià)[13]

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度高溫煅燒貝殼粉懸濁液對(duì)兩種細(xì)菌的抑菌效果

表2 為不同濃度貝殼粉對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果。由表2 可知，隨著高溫煅燒貝殼粉懸濁液濃度增加，對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制效果增大。當(dāng)濃度達(dá)到0.05%時(shí)，高溫煅燒貝殼粉懸液對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌率均大于99.99%，表現(xiàn)出優(yōu)異的抑菌性能。然而，0.01%的高溫煅燒貝殼粉懸液對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌率分別為92.50%和47.33%，結(jié)果表明其對(duì)大腸桿菌具有明顯的抑菌性能，而對(duì)金黃色葡萄球菌幾乎不具有抑菌性能。同時(shí)表明低濃度的貝殼粉懸液，抗大腸桿菌性能比抗金黃色葡萄球菌性能好。

表2 不同濃度貝殼粉對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果

2.2 作用時(shí)間對(duì)兩種細(xì)菌的殺菌效果

表3 為1%濃度貝殼粉懸濁液作用時(shí)間對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的殺菌效果。由表3 可知，1.0%的貝殼粉懸液對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌作用0min 的殺菌率分別為5.56%和34.29%；隨著時(shí)間延長(zhǎng)，5min 后對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的殺菌率分別為99.99%和99.50%。表明1.0%的貝殼粉懸液對(duì)菌濃度在108cfu/mL 數(shù)量級(jí)的大腸桿菌作用5 min 后，即可幾乎全部殺滅。10min 之后培養(yǎng)液中的兩種幾乎全部被殺滅（殺菌率大于99.99%）。說(shuō)明1.0%的貝殼粉懸液對(duì)菌濃度在108cfu/mL 數(shù)量級(jí)的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌作用僅10 min 即可幾乎全部殺滅，具有優(yōu)異的殺菌性能。

表3 1%濃度貝殼粉懸濁液作用時(shí)間對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的殺菌效果

2.3 濾紙片法分析

表4 為高溫煅燒貝殼粉對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌濾紙片法抑菌效果。由表4 可知，對(duì)照組濾紙樣品周圍長(zhǎng)滿大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，無(wú)抑菌圈產(chǎn)生，相比對(duì)照組，所有負(fù)載不同濃度貝殼粉的濾紙片均產(chǎn)生了抑菌環(huán)，相同樣品對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌環(huán)寬度比大腸桿菌的抑菌環(huán)寬度大，并且隨著高溫煅燒貝殼粉懸液濃度的增加，抑菌環(huán)寬度也在增加。表明負(fù)載貝殼粉的濾紙片中的貝殼粉可以通過(guò)擴(kuò)散作用擴(kuò)散至培養(yǎng)基中，抑制大腸桿菌及金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)，形成抑菌環(huán)。

表4 高溫煅燒貝殼粉對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌濾紙片法抑菌效果

2.4 最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)的確定

高溫煅燒貝殼粉對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度（MIC）如表5 所示，陰性對(duì)照未出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象，大腸桿菌陽(yáng)性對(duì)照組及金黃色葡萄球菌陽(yáng)性對(duì)照組均變渾濁。高溫煅燒貝殼粉濃度在313 ppm 以上時(shí)，試管均未出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象，當(dāng)樣品濃度小于等于250 ppm 時(shí)，試管中的培養(yǎng)液變渾濁，且渾濁度隨著濃度降低而增加。可確定高溫煅燒貝殼粉樣品時(shí)對(duì)大腸桿菌（和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度（MIC）均為313 ppm。

表5 高溫煅燒貝殼粉對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度（MIC）

表6 為高溫煅燒貝殼粉對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小殺菌濃度（MBC）。由表6 可知，陰性對(duì)照未出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象，大腸桿菌陽(yáng)性對(duì)照組及金黃色葡萄球菌陽(yáng)性對(duì)照組均變渾濁，進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)時(shí)發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性對(duì)照基本滿板生長(zhǎng)。高溫煅燒貝殼濃度在250 ppm 及其以下時(shí)，平板中細(xì)菌多不可計(jì)；樣品濃度為313 ppm 時(shí)，平板中有少量細(xì)菌生長(zhǎng)；樣品濃度為500 ppm 時(shí)，金黃色葡萄球菌僅4 個(gè)菌落生長(zhǎng)，大腸桿菌僅3 個(gè)菌落生長(zhǎng)；當(dāng)濃度在625 ppm 及其以上時(shí)，平板中均無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。以上結(jié)果與高溫煅燒貝殼粉對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度均為313 ppm 也是一致的。綜上，確定高溫煅燒貝殼粉樣品對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小殺菌濃度（MBC）均為500 ppm。

表6 高溫煅燒貝殼粉對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小殺菌濃度（MBC）

2.5 高溫煅燒貝殼粉對(duì)黑曲霉菌抑制效果

表7 為霉菌生長(zhǎng)平板圖。由表7 可知，對(duì)照組培養(yǎng)基表面黑曲霉菌絲及黑曲霉孢子覆蓋面積大于60%，陽(yáng)性對(duì)照培養(yǎng)基表面有大量黑曲霉菌絲及黑曲霉孢子生長(zhǎng)。陰性對(duì)照培養(yǎng)基表面無(wú)黑曲霉菌絲及黑曲霉孢子生長(zhǎng)，對(duì)照樣培養(yǎng)基表面存在大量黑曲霉菌絲及黑曲霉孢子，試驗(yàn)樣培養(yǎng)基表面無(wú)黑曲霉菌絲及黑曲霉孢子生長(zhǎng)，判定1.0%貝殼粉對(duì)黑曲霉的防霉等級(jí)為0級(jí)。為探究高溫煅燒貝殼粉的殺霉率，表9 結(jié)果表明，振蕩培養(yǎng)12 h 后，通過(guò)在PDA 培養(yǎng)基平皿中菌落計(jì)數(shù)，對(duì)照組培養(yǎng)液中活菌數(shù)為2.7×104個(gè)/mL，實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)液中活菌數(shù)為10 個(gè)/mL，對(duì)黑曲霉的殺滅率為99.96%。

表7 霉菌生長(zhǎng)平板圖

表8 高溫煅燒貝殼粉對(duì)黑曲霉抑制性能評(píng)價(jià)

3 結(jié)論

3.1 通過(guò)研究牡蠣殼所制備的高溫煅燒貝殼粉對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌能力和殺菌效果，結(jié)果表明，0.05%的高溫煅燒貝殼粉懸濁液對(duì)兩種致病菌的抑制率達(dá)到99%以上，0.01%的高溫煅燒貝殼粉對(duì)大腸桿菌的抑制效果比金黃色葡萄球菌的抑制效果好。1.0%濃度的貝殼粉作用5min 即可殺滅99%的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌。隨著懸濁液濃度的增加，對(duì)兩種致病菌的抑菌圈寬度增大，1.0%懸液對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌環(huán)寬度分別為0.40 mm 和0.85 mm。這些結(jié)果表明，低濃度的高溫貝殼粉懸濁液具有一定的殺菌和抑菌作用，其抑菌機(jī)理還需進(jìn)一步探究[15]。

3.2 1.0%含量的貝殼粉與無(wú)機(jī)鹽瓊脂培養(yǎng)基所形成的混合物對(duì)黑曲霉的防霉等級(jí)為0 級(jí)，具有優(yōu)異的防霉性能。1.0%含量的貝殼粉對(duì)黑曲霉孢子作用12 h 的殺滅率達(dá)到99.96%，具有優(yōu)異的殺霉性能。