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    FQ-PCR方法檢測(cè)腹瀉仔豬腸道內(nèi)乳酸桿菌和雙歧桿菌試驗(yàn)

    2021-10-17 13:39:44王志宇段昌學(xué)王志俊劉一飛韓潔茹李正莉
    養(yǎng)豬 2021年5期
    關(guān)鍵詞:離心管雙歧緩沖液

    趙 娟,王志宇,段昌學(xué),王志俊,劉一飛,趙 敏,韓潔茹,李正莉

    (1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,山西 太原 030032;2.陜西省商洛市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,陜西 商洛 726000)

    腸道菌群種類繁多,菌群計(jì)量及檢測(cè)有較大困難,國(guó)內(nèi)外學(xué)者已建立了許多診斷方法,如細(xì)菌分離鑒定、凝集試驗(yàn)、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、熒光抗體技術(shù)、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))試劑盒等,但這些方法均費(fèi)時(shí)費(fèi)力,而且靈敏性均不理想,不適用于常規(guī)的臨床診斷,更不適用于集約化生產(chǎn)中細(xì)菌檢測(cè)的需要。隨著分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的快速發(fā)展,以及聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)的廣泛應(yīng)用,特別是16S rRNA被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌的鑒定,分子生物學(xué)檢測(cè)方法PCR用于Lactobacillus和Bifidobakterien定量的檢測(cè)具有快速、靈敏、特異等優(yōu)點(diǎn),但假陽(yáng)性較多,缺乏準(zhǔn)確定量等缺點(diǎn)限制了PCR在實(shí)際臨床中的應(yīng)用[1]。近年來(lái),F(xiàn)QPCR技術(shù)以其特異性強(qiáng)、靈敏度高、穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)在微生物的定性和定量檢測(cè)等方面得到廣泛應(yīng)用。本研究建立了快速檢測(cè)Lactobacillus和Bifidobakterien的FQ-PCR方法,不僅保留了PCR的優(yōu)點(diǎn),而且克服了普通PCR的不足,為動(dòng)物腸道微生態(tài)的測(cè)定建立了一種更為有效的方法[2]。

    1 材料與方法

    1.1 儀器設(shè)備

    微量移液器(Eppenderf公司,10 μL、100 μL、200 μL、1 000 μL型),PCR儀(QIAGEN,Rotor-Gene Q型),高速低溫離心機(jī)(Sigma,2-16PK型),電子天平(METTLER TOLEDO,AL104-IC型),高速離心機(jī)(Eppendorf,1-14型),摩爾基因型超純水機(jī)(上海摩勒生物科技有限公司,MO6-063型),立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠,YXQ-LS-SⅡ型),電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海聯(lián)進(jìn)醫(yī)療器械廠,101-2-BS-Ⅱ型),超低溫冰箱(中科美菱公司)。

    1.2 主要試劑和材料

    QIAamp DNA Stool Mini Kit購(gòu)自Qiagen公司;TransStart?Probe qPCR SuperMix購(gòu)自Qiagen公司;酒精為國(guó)產(chǎn)試劑。

    1.5 mL進(jìn)口薄壁離心管購(gòu)自Corning公司;0.2 mL進(jìn)口薄壁離心管購(gòu)自Corning公司;0.2 mL平蓋八排管購(gòu)自Axygen公司;5 mL有蓋離心管為國(guó)產(chǎn);1 mL、200 μL、10 μL吸頭均為國(guó)產(chǎn);一次性使用棉簽、手套、口罩為國(guó)產(chǎn)。試驗(yàn)材料(腹瀉仔豬和健康仔豬的糞便樣本)來(lái)源于山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所豬場(chǎng)及山西省天祿豐種豬場(chǎng)。

    2 試驗(yàn)步驟

    2.1 設(shè)計(jì)qPCR引物[3]

    引物序列見(jiàn)表1。

    表1 引物序列

    2.2 采集糞便樣品

    2020年9月23日至10月23日,在天氣溫度驟降仔豬腹瀉高發(fā)期或仔豬腹瀉發(fā)病集中期,項(xiàng)目組在太原市小店區(qū)南郊繁峙鎮(zhèn)的宏利豬場(chǎng)、山西省運(yùn)城市夏縣眾旺養(yǎng)殖專業(yè)合作社、夏縣宏偉農(nóng)牧有限公司、夏縣健源養(yǎng)殖專業(yè)合作社、夏縣嘉博養(yǎng)殖有限公司等多地采取典型病例糞便作為試驗(yàn)樣本。用棉簽將健康仔豬和腹瀉仔豬糞便采集入已消毒的5 mL離心管內(nèi),封蓋。每份樣品貼標(biāo)簽,詳細(xì)注明日期、組織來(lái)源、編號(hào)。注意樣品一定為新鮮糞便。采集到的樣本帶回實(shí)驗(yàn)室-80 ℃保存。分3批次采集樣本,每批次采集健康仔豬糞便和腹瀉仔豬糞便各20份。

    2.3 糞便中總DNA提取

    1)稱取180~220 mg糞便加入預(yù)冷的2 mL離心管中;2)每管加入1.4 mL的緩沖液ALS(試劑),渦旋使其完全混勻;3)370 ℃孵育5 min,使其完全裂解;4)渦旋混勻15 s,14 000 r/min離心1 min;5)取1.2 mL的上清液至新的2 mL離心管中,棄沉淀;6)每管加入一片InhibitEX Tablet,立即渦旋直至完全混勻,室溫孵育1 min;7)14 000 r/min離心3 min;8)取全部上清液至新的1.5 mL離心管中,棄沉淀,14 000 r/min離心3 min;9)取新的1.5 mL離心管,每管提前加入15 μL蛋白酶K;10)從第8步中移200 μL上清液至新的1.5 mL離心(已加蛋白酶K)管中;11)加入200 μL的緩沖液,渦旋混勻15 s;12)70 ℃孵育10 min;13)加入200 μL的無(wú)水乙醇,完全混勻;14)將全部的上清加入QIAamp spin column柱中,14 000 r/min離心1 min,棄收集管廢液,將柱子重新放入新的收集管中;15)加入500 μL的AW1緩沖液,14 000 r/min離心1 min,將柱子移至新的2 mL收集管中;16)加入500 μL的AW2緩沖液,14 000 r/min離心3 min,棄收集管廢液,將柱子重新放入新的收集管中;17)將柱子放入新的1.5 mL離心管中,14 000 r/min離心1 min;18)將柱子放入新的1.5 mL離心管中,加入200 μL的緩沖液AE,14 000 r/min離心1 min;19)將提取好的DNA做標(biāo)記,-80 ℃長(zhǎng)期保存。

    2.4 熒光定量PCR

    2.4.1 將DNA從-20 ℃冰箱拿出后置于冰上解凍。

    2.4.2 按照以下反應(yīng)體系配置反應(yīng)體系于平蓋八排管中(表2)。

    表2 熒光定量PCR反應(yīng)體系

    2.4.3 將八排管的管蓋輕輕蓋到八排管上;將八排管放入熒光定量PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)并設(shè)置參數(shù),PCR反應(yīng)程序如下(表3)。

    表3 熒光定量PCR反應(yīng)程序

    2.4.4 待PCR結(jié)束后,按照Ct值計(jì)算檢測(cè)基因的表達(dá)情況[4]。

    3 試驗(yàn)結(jié)果

    (1)糞便中所提取全DNA濃度及純度見(jiàn)表4。

    表4 第1~3批次樣本中提取的全DNA濃度及純度

    (2)CT值大,說(shuō)明拷貝數(shù)小,樣本本身mRNA的數(shù)量少。從圖1、圖2中可以看出,健康組和腹瀉組相比,腹瀉組的CT值大,說(shuō)明其樣本本身所含的mRNA的量少,即:相對(duì)比健康仔豬來(lái)說(shuō),腹瀉仔豬中乳酸桿菌和雙歧桿菌的mRNA的量都少。說(shuō)明因?yàn)楦篂a,仔豬腸道中乳酸桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量減少,腹瀉影響了仔豬腸道環(huán)境微生態(tài)的平衡和健康[5]。

    圖1 樣本中雙歧桿菌擴(kuò)增CT值示意圖

    圖2 樣本中乳酸桿菌擴(kuò)增CT值示意圖

    (3)斷奶仔豬腹瀉的原發(fā)性因素主要是由于斷奶應(yīng)激引起機(jī)體神經(jīng)內(nèi)分泌紊亂,腸道微生物區(qū)系平衡遭到破壞,造成治病菌大腸桿菌的增殖,益生菌減少,從而導(dǎo)致更為嚴(yán)重的腹瀉,所以補(bǔ)充益生菌能夠有效防治仔豬腹瀉的發(fā)生,為獸醫(yī)臨床防治斷奶仔豬腹瀉提供理論依據(jù)[6]。

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