黃連解毒湯對APP/PS1 小鼠海馬記憶功能的影響

李洋，徐加志，張英華，胡靈佳，賈翠翠，孫磊

（齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161000）

0 引言

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種與老齡化密切相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病[1]。縱觀世界人口老齡化的發(fā)展趨勢，AD 現(xiàn)已成為嚴(yán)重的老年人疾病，僅次于腫瘤和心血管疾病，所以，預(yù)防和治療AD 的發(fā)生發(fā)展就成了目前關(guān)鍵的問題。β-淀粉樣蛋白（Amyloid beta，Aβ）沉積形成老年斑（Senile plaque，SP）是AD 主要病理特征之一，SP形成后會(huì)使神經(jīng)突觸遭到破壞，喪失部分功能[2-3]。同時(shí)，有研究表示，AD 患者腦部突觸發(fā)生損害，會(huì)嚴(yán)重導(dǎo)致記憶的缺失[4]。在AD 疾病中，IL-1β 表達(dá)的增高與Aβ 沉積密切相關(guān)[5]。目前國內(nèi)外對于治療AD 的方法有很多，但效果并不理想。祖國醫(yī)藥黃連解毒湯經(jīng)過證實(shí)具有清熱、解毒、抗炎等功效[6-8]，因此，本研究通過觀察黃連解毒湯對APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠IL-1β 和TNF-α 表達(dá)的影響，探討HLJDT對AD 疾病的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物

5 月齡APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠，雄性，16 只，同窩同背景野生小鼠，雄性，8 只作為對照，均購自南京生物醫(yī)藥研究院，生產(chǎn)編號(hào)為：SCXK（蘇）2015-0001。由齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)，本實(shí)驗(yàn)獲得齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 藥物制備及分組給藥

黃連解毒湯由黃連（9g）、黃芩（6g）、黃柏（6g）和梔子（9g）4 味組成，均購買于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院。由醫(yī)藥科學(xué)研究院制成質(zhì)量濃度為433g·kg-1的藥液備用。并將5 月齡APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠分為模型組和HLJDT組（433g·kg-1），每組8只。對照組為野生小鼠。對照組和模型組小鼠均給予等體積的生理鹽水（0.2mL·kg-1），連續(xù)灌胃35d。

1.1.3 儀器和試劑

Morris 水迷宮（上海移數(shù)信息技術(shù)公司，型號(hào)RD1101-MWM 型）；組織研磨器（北京天根，型號(hào)TGrinder）；小鼠IL-1β 和TNF-α 抗體（Abcam，貨號(hào)ab234473 和ab183218）。

1.2 方法

1.2.1 morris 水迷宮檢測

水迷宮是一個(gè)圓形水池，水池中心是透明厚板平臺(tái)，上方連接追蹤設(shè)備，池壁由紅、黃、藍(lán)、綠標(biāo)記4 個(gè)象限。定位航行實(shí)驗(yàn)：連續(xù)5d 對小鼠進(jìn)行訓(xùn)練，記錄小鼠的潛伏期，即60s 內(nèi)找到平臺(tái)的時(shí)間；空間探索實(shí)驗(yàn)：攝像機(jī)追蹤拍攝小鼠的運(yùn)動(dòng)軌跡，觀察軌跡的變化情況。

1.2.2 新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)在一個(gè)黑色封閉箱中進(jìn)行。適應(yīng)期：連續(xù)3d 將小鼠放入封閉箱中，每次10min。熟悉期：在箱里邊緣對稱的位置放2 個(gè)體積大小都相同的紅色正方體木塊，并將小鼠放于箱內(nèi)5min。測試期：30min 后，綠色圓柱形積木替換箱內(nèi)其中一個(gè)積木塊，記錄5min 小鼠對綠色圓柱形積木即新穎事物(T novel，TN) 和紅色正方體即熟悉事物(T familiar，TF) 的探索行為，認(rèn)知指數(shù)(recognition index，RI)=TN/ (TN+TF) ×100%。

1.2.3 RT-qPCR 檢測

50mg 組織中 加500μl Trizol，研磨勻漿，提取總RNA，再將RNA 反轉(zhuǎn)成cDNA，設(shè)計(jì)特異性引物：IL-1β 引物（F：5 ′ -GAAATGCCACCTTTTGACAGTG-3 ′；R：3 ′ -TGGATGCTCTCATCAGGACAG-5 ′），TNF-α 引物（F：5 ′ -CTGAACTTCGGGGTGATCGG-3 ′）GAPDH 引物（F：5 ′ -GAGACCTTCAACACCCCAGC-3 ′；R：3′-CCACAGGATTCCATACCCAA-5′），加SYBR Green I 熒光染料，結(jié)果采用2-ΔΔCt法計(jì)算。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 潛伏期

潛伏期時(shí)間的長短代表著小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的好壞，潛伏期短，預(yù)示著小鼠學(xué)習(xí)記憶能力好，反之，小鼠記憶能力減退。

1.3.2 運(yùn)動(dòng)軌跡

小鼠運(yùn)動(dòng)軌跡的不斷變化能夠清晰的看出學(xué)習(xí)記憶能力的改變。經(jīng)過多次訓(xùn)練的小鼠會(huì)很快搜索到平臺(tái)，表明學(xué)習(xí)記憶的提高；而記憶力差的小鼠則圍繞池壁來回搜尋，卻始終找不到平臺(tái)。

1.3.3 認(rèn)知指數(shù)

觀察小鼠是否對新物品感興趣，若否，則認(rèn)為小鼠有記憶缺失的可能。

1.3.4 IL-1β、TNF-α mRNA 的表達(dá)

觀察HLJDT 對IL-1β、TNF-α mRNA 表達(dá)的影響，判斷是否可通過調(diào)節(jié)促炎因子的表達(dá)使小鼠記憶能力得到改善。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 水迷宮檢測結(jié)果

2.1.1 對小鼠潛伏期的影響

與對照組進(jìn)行比較，第1d 和第2d，模型組和HLJDT 組小鼠潛伏期無明顯變化（P>0.05）；第3d、4d、5d，模型組潛伏期明顯長于對照組（P<0.05）；與模型組比較，HLJDT 組小鼠潛伏期明顯縮短（P<0.05），見圖1。

圖1 訓(xùn)練時(shí)三組小鼠的潛伏期

2.1.2 運(yùn)行軌跡變化

對照組小鼠通過前5d 的訓(xùn)練，可以在短時(shí)間內(nèi)找到平臺(tái)；模型組小鼠只在池壁邊緣搜尋，且不能找到平臺(tái)；HLJDT 組雖圍繞池壁搜尋，但最終可以找到平臺(tái)，見圖2。

圖2 各組小鼠典型游泳軌跡

2.2 新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)

與對照組比較，模型組小鼠RI 降低（P<0.05）；與模型組比較，HLJDT 組小鼠RI 明顯升高（P<0.05），見圖3。

圖3 各組小鼠的認(rèn)知指數(shù)

2.3 RT-qPCR 檢測結(jié)果

與對照組比較，模型組小鼠IL-1β、TNF-α mRNA 水平均明顯升高（P<0.05）；與模型組比較，HLJDT 組小鼠IL-1β、TNF-α mRNA 水平均明顯降低（P<0.05），見圖4。

圖4 RT-qPCR 檢測各組小鼠海馬區(qū)IL-1β、TNF-α mRNA 水平的比較

3 討論

AD 是一種隨著年紀(jì)增加而在老年時(shí)期表現(xiàn)為“癡呆”的疾病?！鞍V呆”與年齡有著密切的關(guān)系。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)老年人會(huì)在50 歲以后發(fā)病，60 歲以上的老年人發(fā)病率最高[9-10]。AD 主要表現(xiàn)為記憶力減退，伴有嚴(yán)重的認(rèn)知障礙[11]，隨著病情的惡化，患者的生活能力會(huì)逐漸喪失，也會(huì)給家庭帶來沉重的負(fù)擔(dān)。

國內(nèi)外研究學(xué)者對AD 疾病的預(yù)防和治療已經(jīng)研究逾百年，提出了β-淀粉樣蛋白學(xué)說、膽堿能損傷學(xué)說等[12-13]，但都沒有明確AD 的發(fā)病機(jī)制。臨床上治療AD 的藥物也研發(fā)了多種，但藥物的顯著性尚不明了。炎癥因子學(xué)說的提出，為AD 的治療提出了新的研究方向，有研究顯示，神經(jīng)炎癥的發(fā)生是由于腦組織中小膠質(zhì)細(xì)胞的存在[14]，當(dāng)AD 發(fā)生時(shí)，會(huì)有大量的Aβ 沉積，就會(huì)激活小膠質(zhì)細(xì)胞釋放大量的促炎因子IL-1β 和TNF-α，嚴(yán)重影響疾病的治療[15-16]。

中醫(yī)認(rèn)為治療AD 的主要環(huán)節(jié)應(yīng)在“清熱解毒、化痰消炎”。黃連解毒湯是清熱解毒方的代表，在《肘后備急方》中首次記載了藥物組成[17]。此方由黃連、黃芩、黃柏、梔子四味中藥按3 ∶2 ∶2 ∶3的比例配伍而成，經(jīng)研究表明，其具有抗炎、抗菌、抗氧化、清熱解毒的功效，在臨床應(yīng)用中常被用于治療AD、帕金森、癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)疾病。

本研究Morris 水迷宮結(jié)果表明，模型組潛伏期有所增加，長于對照組，而HLJDT 組潛伏期從第3天開始逐漸縮短，小鼠反應(yīng)不再遲鈍；通過觀察小鼠運(yùn)動(dòng)軌跡我們發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力較差，只圍繞池壁來回搜尋，而HLJDT 組小鼠則能夠找到平臺(tái)，顯著提高了學(xué)習(xí)記憶能力。新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)中，模型組小鼠認(rèn)知指數(shù)降低，而HLJDT 組小鼠認(rèn)知指數(shù)明顯升高，說明HLJDT 能改善APP/PS1小鼠的學(xué)習(xí)和空間記憶能力，使“癡呆”樣癥狀得到緩解。

綜上所述，RT-qPCR 檢測結(jié)果顯示，HLJDT 可降低APP/PS1 小鼠海馬區(qū)IL-1β 和TNF-α mRNA 的表達(dá)，對神經(jīng)炎癥的發(fā)展起到了保護(hù)作用。因此，本研究得出，HLJDT 可通過調(diào)節(jié)促炎因子的釋放來發(fā)揮對AD 的保護(hù)作用，這也為AD 疾病的治療提供新的研究思路。